化學發光法直接標記抗原檢測丙型肝炎病毒抗原抗體及檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了化學發光法直接標記抗原檢測丙型肝炎病毒抗原抗體及檢測試劑盒。本發明專利技術通過分析丙型肝炎病毒序列而得到2株抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體(AbI，AbII)，2種丙型肝炎病毒重組抗原(AgI，AgII)，且2株抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體與2種丙型肝炎病毒重組抗原之間兩兩不發生交叉反應。使用其中的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI、丙型肝炎病毒重組抗原AgI作為包被原料，其中的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbII、丙型肝炎病毒重組抗原AgII作為標記原料，用雙抗體夾心法檢測丙型肝炎病毒抗原，用雙抗原夾心法檢測丙型肝炎病毒抗體。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及化學發光法直接標記抗原檢測丙型肝炎病毒抗原抗體及檢測試劑盒，屬于化學發光法以及體外診斷檢測領域。
技術介紹
丙型肝炎病毒Ofepatitis C virus, HCV)呈球形，直徑小于80nm(在肝細胞中為36 40nm，在血液中為36_62nm)，為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質的囊膜，囊膜上有刺突。丙型肝炎病毒可引起丙型肝炎主要經輸血，針刺，吸毒等傳播。HCV感染通常是持續性的終生感染，抗體檢測是一個非常有效的方法。但因感染HCV后，抗HCV出現較慢，一般情況下，抗體的血清學轉換可以延遲到暴露后幾個月才發生，此時可發生抗HCV的假陰性(也就是說在抗體可檢出之前或在血清學轉換之中即所謂的“窗口期”)，故在早期診斷丙肝感染上有困難。HCV核心抗原檢出時間早于抗體，HCV-cAg檢測可作為HCV抗體檢測的補充試劑。目前丙型肝炎的檢測方法主要有三類1.丙型肝炎抗體檢測其缺點是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2-26周的潛伏期，一般到抗HCV抗體出現(轉陽)有一個較長的窗口期，平均為70d，有的患者窗口期可延長至6-9個月或更長。由于窗口期的存在，對潛伏期和隱形感染者容易造成漏檢，機體感染HCV后，在抗HCV抗體出現之前約2周左右，血循環中即可出現病毒顆粒，此時丙型肝炎病毒HCV的RNA經PCR方法檢測可為陽性，血液具有感染性，而用抗體檢測方法根本無法測出。2.丙型肝炎病毒HCV核酸檢測感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即可檢測到HCV-RNA。因此，HCV核酸檢測(HCV RT-PCR檢測)可用于丙型肝炎的早期診斷，并且通過對病毒拷貝數的定量檢測可對其臨床療效進行監測。因為PCR法檢測HCV-RNA影響因素較多，在樣本收集、儲存和檢測方面都有嚴格的要求，并且PCR的檢測操作過程復雜、費時。3.丙型肝炎抗原檢測丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最為保守的部分編碼而來，在HCV-RNA出現后的l-2d內即出現丙型肝炎病毒HCV抗原，且與HCV-RNA的水平相平行，可以作為HCV復制的標志。有研究表明，HCV抗原檢測與抗HCV抗體檢測相比，HCV抗原的檢測可使檢測的窗口期平均提前49天，縮短窗口期HCV感染者的獻血的風險。與RT-PCR方法相比具有操作簡便、時間短、對環境要求低的特點，在臨床上可用于早期急性丙型肝炎診斷。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種化學發光法直接標記抗原檢測丙型肝炎病毒抗原抗體及檢測試劑盒，主要解決現有技術存在的靈敏度低、穩定性差、操作煩瑣及污染環境等技術問題。最主要解決的問題是縮短窗口期，可用于早期急性丙型肝炎診斷。本專利技術采用化學發光法，直接標記抗原聯合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體。該專利技術建立雙抗夾心的基礎之上，在這里，樣品中的抗原抗體首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abl、丙型肝炎病毒重組抗原AgI捕獲。在洗掉樣品的其它部分，再加入HRP標記物(HRP標記抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI1、丙型肝炎病毒重組抗原AgII)，就可以形成單克隆抗體Ab1-丙型肝炎病毒抗原-單克隆抗體AbII HRP標記物復合物與重組抗原Ag1-丙型肝炎病毒抗體-重組抗原AgII HRP標記物復合物，洗板加入A液、B液，用化學發光分析儀測量發光值，發光值與樣本中抗原抗體總濃度呈正相關，與臨界值相比較，從而判斷陰陽性。與現有技術相比，本專利技術具 有以下突出優點1.本專利技術采用丙型肝炎抗原抗體聯合檢測大大縮短窗口期。現階段丙型肝炎的檢測一般是檢測丙型肝炎抗體其缺點是感染丙型肝炎病毒后，有2-26周的潛伏期，一般到抗HCV抗體出現(轉陽)有一個較長的窗口期，平均為70d，有的患者窗口期可延長至6-9個月或更長。由于窗口期的存在，對潛伏期和隱形感染者容易造成漏檢。本專利技術采用丙型肝炎抗原檢測，丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最為保守的部分編碼而來，在HCV-RNA出現后的l-2d內即出現丙型肝炎病毒HCV抗原，且與HCV-RNA的水平相平行，可以作為HCV復制的標志。有研究表明，HCV抗原檢測與抗HCV抗體檢測相比，HCV抗原的檢測可使檢測的窗口期平均提前49天，縮短窗口期HCV感染者的獻血的風險。本專利技術應用聯合檢測能夠將抗原與抗體檢測的優勢據發揮出來，且本專利技術具有操作簡便、時間短、對環境要求低的特點，在臨床上可用于早期急性丙型肝炎診斷。2.本專利技術是采用先進的化學發光法。化學發光法靈敏度高、線性范圍寬、標記物的有效期長、無放射性危害。本專利技術的技術方案是在進行檢測前需完成下列準備工作首先制備包被板，所用的包被板為特異性抗原抗體包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測包被板條的制備包括以下步驟(I)將純化的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abl、丙型肝炎病毒重組抗原AgI用50mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋，稀釋至O. 1_10 μ g/ml，然后加入包被板條各孔內，經吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測包被板條；(2)將丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。其次是丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測HRP標記物的制備，包括以下步驟取5mgHRP溶于1. Oml NaHCO3溶液，充分溶解HRP。加入適量O. 06M NaIO4 ;室溫避光攪拌30分鐘。移入透析袋，用O. 01M，pH9. 6碳酸鹽緩沖液透析過夜。取純化標記原料(抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abll、丙型肝炎病毒重組抗原AgII按照質量比為1: 1混合)511^，用0.01現的NaHCO3,溶液充分溶解，與酶液混合，裝入透析袋，用O. 01M, pH9. 6碳酸鹽緩沖液4°C避光透析24小時，換液4次。取透析后結合液，加入O. 2ml 0.4% NaBH4攪拌30分鐘后，4°C放置4小時。將透析液上S印hadex G-200層析柱，用O. 01M, PH7. 2的PBS洗脫，收集第一個的洗脫峰，稀釋為HRP標記物工作液后2-8°C保存備用。檢測操作過程I)試劑的準備2)丙型肝炎病毒抗原抗體陰陽性對照品及待檢樣本，按順序加入微孔反應條小孔中并加貼封片。3)水浴4)洗板。5)加入標記物工作液6)水浴孵育7)洗板8)加 A 液，B 液 9)測值10)與臨界值比較后判斷結果。具體實施實例I制備包被板，所用的包被板為特異性抗原抗體包被的微孔板，丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測包被板條的制備包括以下步驟(I)將純化的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI用50mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋至3 μ g/ml、丙型肝炎病毒重組抗原AgI用50mmol/L碳酸鹽緩沖液稀釋至6 μ g/ml,然后將兩種包被液按照1:1比例混合后加入包被板條各孔內，經吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測包被板條；(2)將丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。2丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測酶標記物的制備，包括以下步驟取5mg HRP溶于1. OmlNaHCO3溶液，充分溶解HRP。加入適量O. 06M NaIO4 ;室溫避光攪拌30分鐘。移入透析袋，用O. 01M, pH9. 6碳酸鹽緩沖液透析過夜。取純化標記原料(抗丙型肝炎病毒抗原單克本文檔來自技高網...

【技術保護點】
“化學發光法直接標記抗原檢測丙型肝炎病毒抗原抗體”，其特征在于如下檢測原理：本專利技術采用化學發光法，聯合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體。該專利技術建立雙抗夾心的基礎之上，在這里，樣品中的抗原抗體首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbI、丙型肝炎病毒重組抗原AgI捕獲。在洗掉樣品的其它部分，再加入HRP標記物(HRP標記抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體AbII、丙型肝炎病毒重組抗原AgII)，就可以形成單克隆抗體AbI?丙型肝炎病毒抗原?單克隆抗體AbII?HRP標記物復合物與重組抗原AgI?丙型肝炎病毒抗體?重組抗原AgII?HRP標記物復合物，洗板加入A液、B液，用化學發光分析儀測量發光值，發光值與樣本中抗原抗體總濃度呈正相關，與臨界值相比較，從而判斷陰陽性。

【技術特征摘要】
1.“化學發光法直接標記抗原檢測丙型肝炎病毒抗原抗體”，其特征在于如下檢測原理本發明采用化學發光法，聯合檢測丙型肝炎病毒抗原抗體。該發明建立雙抗夾心的基礎之上，在這里，樣品中的抗原抗體首先被包被于微孔板上的抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abl、丙型肝炎病毒重組抗原AgI捕獲。在洗掉樣品的其它部分，再加入HRP標記物(HRP 標記抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體Abll、丙型肝炎病毒重組抗原AgII)，就可以形成單克隆抗體Ab1-丙型肝炎病毒抗原-單克隆抗體AbII HRP標記物復合物與重組抗原Ag1-丙型肝炎病毒抗體-重組抗原AgII HRP標記物復合物，洗板加入A液、B液，用化學發光分析儀測量發光值，發光值與樣本中抗原抗體總濃度呈正相關，與臨界值相比較，從而判斷陰陽性。2.化學發光法直接標記抗原檢測丙型肝炎病毒抗原抗體檢測試劑盒，其特征在于包括盒體，設在盒體內的包被板和設在盒體內試劑及不干膠封片和使用說明書。3.根據權利要求2所述包被板，其特征在于包被板上包被的是抗丙型肝炎病毒抗原單克隆抗體與丙型肝炎病毒重組抗原，制備工藝是將包被抗體用包被緩沖液稀釋作為包被液，包被反應板，并用封閉液封閉。4.根據權利要求3所述包被緩沖液...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張年，
申請(專利權)人：張年，
類型：發明
國別省市：