本發明專利技術提供一種檢測呋喃西林代謝物酶聯免疫試劑盒及其方法，酶聯免疫試劑盒包括：包被有包被原的酶標板、呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標記物、呋喃西林代謝物標準溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液，2-硝基苯甲醛。本發明專利技術還提供了一種呋喃西林代謝物酶聯免疫試劑盒檢測方法，主要包括：先進行樣本前處理，再用試劑盒進行檢測，最后分析檢測結果。本發明專利技術的檢測試劑盒能夠同時快速檢測動物組織、水產品中呋喃西林代謝物藥物，具有操作簡便、快速、準確、靈敏度高、費用低廉等特點，適合大量樣本的篩查和現場監控。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種檢測動物組織(肌肉、肝臟)、水產品中呋喃西林代謝物的酶聯免疫試劑盒及檢測方法。
技術介紹
硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛應用，作為禽類、水產和豬促生長的添加劑。但在長時間的實驗研究過程中發現，硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發生癌變和基因突變，正因為如此才導致此類藥物禁止在治療和飼料中使用。由于硝基呋喃類原型藥在生物體內代謝迅速，無法檢測，但其代謝產物因和蛋白質結合而相當穩定，所以在分析此類藥物的殘留時經常要分析其代謝后的產物，管理部門就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。呋喃西林作為硝基呋喃類藥物的一種，代謝產物為SEM。目前用來檢測硝基呋喃類代謝物的最常用方法是LC-UV、LC-MS和 LC-MS/MS，與之相比，酶聯免疫方法具有高精確度和靈敏度、較低的操作技術要求、短暫的檢測時間、較大的檢測樣本量等特點，能夠更好地滿足我國畜禽養殖戶、屠宰 場、食品企業、 政府職能監管部門等開展檢測工作。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種呋喃西林代謝物的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、 準確、簡便、適用于進行大批量樣品篩查的定性、定量檢測方法。本專利技術提供的呋喃西林代謝物酶聯免疫檢測試劑盒，包括包被有包被原的酶標板、呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標記物、標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、 濃縮復溶液、2_硝基苯甲醛，所述包被原為呋喃西林代謝物抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。本專利技術所提供的呋喃西林代謝物酶聯免疫試劑盒，所述呋喃西林代謝物抗原為呋喃西林代謝物半抗原與載體蛋白的偶聯物，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白。所述呋喃西林代謝物特異性抗體為呋喃西林代謝物單克隆抗體，是用呋喃西林代謝物免疫原免疫動物得到的。所述呋喃西林代謝物單克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述呋喃西林代謝物單克隆抗體優選為呋喃西林代謝物鼠單克隆抗體。所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶，酶標記抗抗體是采用過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶與羊抗鼠抗抗體偶聯得到。為了更方便的進行大量樣本篩查和現場監控，所述試劑盒還包括標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、2-硝基苯甲醛。所述標準品溶液為系列呋喃西林代謝物標準品溶液，濃度分別為0μ g/L、 O. 05 μ g/L,O. 15 μ g/L、0. 45 μ g/L、1. 35 μ g/L,4. 05 μ g/L, ImL/ 瓶。所述的終止液為 2mol/L的硫酸溶液，所述底物顯色液A液為過氧化脲溶液，底物顯色液B液為四甲基聯苯胺溶液， 所述濃縮洗滌液為O. 8% 1. 2%吐溫-20和0. 01% 0. 02%的疊氮化鈉防腐劑的O. 2 O. 4mol/LpH7. 6磷酸鹽緩沖液，所述濃縮復溶液為pH值為7. 6，含有9% 12%卵清蛋白、 0.1 0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液。其中所述酶標板在制備過程中所用到的包被緩沖液為pH9. 4 9. 6的O. 05mol/L 的碳酸鹽緩沖液，封閉緩沖液為PH7. 4 7. 6的0. 05% I %的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液。本專利技術酶標板的制備主要為用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1 0. 3 μ g/ml，每孔加入150 μ 1，37°C避光孵育2h，傾去孔中液體，洗滌液洗滌I次，拍干，每孔中加入150 μ I 封閉液，37°C避光孵育2h，傾去孔中液體拍干，用鋁膜真空密閉保存。本專利技術中包被原和免疫原的合成過程為1.半抗原合成(合成路線如圖1)0. 75g呋喃西林代謝物(SEM)和20ml DMF的混合液，室溫下緩慢滴加入 2. 68-5. 36g對苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完畢后室溫至60°C反應2_4小時，除去溶劑，柱層析純化，得到淡黃色SEM衍生物。2.免疫原的合成(I)取呋喃西林代謝物半抗原10mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取BSA40mg用6ml水溶解，得到溶液2。(3)將溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室溫反應24h。(4)取NaBH414mg用0. 2ml-0.1M NaOH溶解后中入溶液3中，4°C反應2h。(5)用O.Olmol/IPBS 4°C透析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物(6)分裝，于_20°C保存備用。3.包被原的合成(1)取呋喃西林代謝物半抗原14mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取OVA50mg用4ml水溶解，得到溶液2。(3)將溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室溫反應24h。(4)取NaBH4IOmg用O. 2ml0.1M NaOH溶解后中入溶液3中，4°C反應2h。(5)用O.Olmol/IPBS 4°C透析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物(6)分裝，于_20°C保存備用。4.單克隆抗體的制備動物免疫呋喃西林代謝物半抗原與載體蛋白偶聯物免疫8-10周齡Bal b/c小質。細胞融合與克隆化取免疫后的鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞在融合劑聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，篩選獲得能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復蘇將雜交瘤細胞用凍存液制成IX 109個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。本專利技術還提供了一種用呋喃西林代謝物酶聯免疫試劑盒檢測樣品中呋喃西林代謝物殘留的方法，采用本方法對動物組織、水產中的呋喃西林代謝物進行定性或定量檢測， 樣本前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣品，試劑盒具有很高的精確度和靈敏度，較低的操作技術要求和短暫的檢測時間，檢測樣本量大等特點，主要步驟包括I)將待測樣品進行前處理，得到待測樣品溶液；2)用酶聯免疫試劑盒檢測待測樣品溶液；3)分析檢測結果。附圖說明圖1 :呋喃西林代謝物半抗原合成圖圖2 :呋喃西林代謝物標準曲線具體實施方式下面結合具體的實施例來進一步闡述本專利技術。應理解，這些實施例僅用于說明本專利技術，而不用來限制本專利技術的范圍。實施例一抗原、抗體及酶標記物的合成1.呋喃西林代謝物半抗原的合成 O. 75g呋喃西林代謝物(SEM)和20ml DMF的混合液，室溫下緩慢滴加入 2. 68-5. 36g對苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完畢后室溫至60°C反應2_4小時，除去溶劑，柱層析純化，得到淡黃色SEM衍生物。質。質。2.免疫原的合成(I)取呋喃西林代謝物半抗原IOmg用ImlDMF溶解，得到溶液I。⑵取BSA40mg用6ml水溶解，得到溶液2。(3)將溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室溫反應24h。(4)取NaBH414mg用O. 2ml0.1M NaOH溶解后中入溶液3中，4°C反應2h。(5)用O.Olmol/IPBS 4°C透析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物(6)分裝，于_20°C保存備用。3.包被原的合成(1)取呋喃西林代謝物半抗原14mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取OVA50mg用4ml水溶解，得到溶液2。(3)將溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室溫反本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種呋喃西林代謝物酶聯免疫檢測試劑盒，其包括包被有包被原的酶標板、呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標記物、標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、2?硝基苯甲醛，所述包被原為呋喃西林代謝物抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。
【技術特征摘要】
1.一種呋喃西林代謝物酶聯免疫檢測試劑盒，其包括包被有包被原的酶標板、呋喃西林代謝物特異性抗體、酶標記物、標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、2-硝基苯甲醛，所述包被原為呋喃西林代謝物抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述呋喃西林代謝物抗原為呋喃西林代謝物半抗原與載體蛋白的偶聯物，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白。3.如權利要求1-2所述的試劑盒，其特征在于所述呋喃西林代謝物半抗原的制備方法主要包括如下步驟O.75g呋喃西林代謝物(SEM)和20ml DMF的混合液，室溫下緩慢滴加入2. 68-5. 36g對苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完畢后室溫至60°C反應2-4小時，除去溶劑，柱層析純化，得到淡黃色SEM衍生物。4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的呋喃西林代謝物特異性抗體為呋喃西林代謝物單克隆抗體。5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體。6.如權利要求1所述的試劑盒，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：萬宇平，馮才茂，馮靜，余厚美，朱亮亮，杜亞菲，劉琳，付軍權，
申請(專利權)人：北京勤邦生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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