與肝病進程相關的檢測試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術公開了保藏號為CGMCC?No.5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株在制備肝病進程相關的檢測試劑或試劑盒中的應用。本發明專利技術所提供的由所述雜交瘤細胞中分泌的單克隆抗體制備的試劑盒可通過血清樣本中多肽標志物Pep5的定量檢測，對肝病進程的發展進行有效的監測，而且操作步驟簡便快捷，利于高通量地臨床檢測，檢測成本低。

【技術實現步驟摘要】
與肝病進程相關的檢測試劑盒及其應用
本專利技術屬于生物
，具體涉及定量檢測與肝病進程相關的酶聯免疫吸附法 檢測試劑盒及其應用。
技術介紹
肝硬化是一種常見的慢性肝病，是由一種或多種病因長期或反復作用引起的肝臟 彌漫性損害。肝纖維化是多種慢性肝病共有的組織學改變。肝纖維化是肝臟對慢性損傷的 一種修復反應，是慢性肝病共有的病理改變，不僅是向肝硬化發展的必由之路，而且貫穿于 肝硬化的全過程。目前“肝炎一肝纖維化一肝硬化一肝癌”，這一鏈條已被認為是各種慢性肝病導致 嚴重后果的共同途徑。臨床研究發現，肝纖維化的診斷方法主要包括影像學、病理學和血清 學診斷3種。影像學診斷主要是B超和CT，在臨床應用廣泛，但只能在肝纖維化晚期，發生 肝硬化和門脈高壓癥時才能出現異常圖像，不能做出早期診斷。肝纖維化的診斷金標準雖 是肝組織活檢，但其本身也存在許多問題，如肝穿刺的盲目性、取材不夠、肝臟病變的不均 一性而導致取樣誤差；雖屬于微創檢查，但多數患者不愿接受，且不能反復取材進行動態觀 察。肝纖維化是發展至肝硬化的必經階段；臨床數據表明，有80%的肝癌患者是由肝 硬化進一步惡化所至。因此，在肝纖維化階段進行早期發現治療，尚有好轉的可能。由此可 以看出肝纖維化的臨床診斷和治療對于慢性肝病極為重要。因此迫切需要一種特異性強、結果可靠、操作性強、簡單可行的對肝纖維化進行檢 測，對肝病進程的發展進行有效監測的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供保藏號為CGMCC No. 5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株在制 備肝病進程相關的檢測試劑或試劑盒中的應用。本專利技術中，特異性定量檢測多肽標志物P印5的單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105， 是以多妝標志物抗原(序列為 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln的多肽，命名為多肽5，簡稱P印5)與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)的偶 聯物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出的雜交瘤細胞株。本專利技術提供的特異性定量檢 測肝病進程相關的多肽標志物P印5的單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105，已于2011年9月 27號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I 號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號為CGMCC No. 5269。本專利技術中，所述的檢測試劑盒優選為酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒。其中，所述的ELISA試劑盒含有辣根過氧化物酶標記的本專利技術所述的單克隆抗 體。其中，所述的ELISA試劑盒還含有包被液、封閉液、顯色液、終止液和固相反應板。其中，所述的ELISA試劑盒進一步含有對多肽標志物進彳丁足量檢測用的校準品、 質控品。進一步，所述包被液優選為碳酸鹽緩沖液、封閉液優選為5%脫脂奶粉、顯色液優 選為TMB顯色液、終止液優選為2M硫酸、固相反應板優選96孔聚丙乙烯微孔板。所述校準品、質控品為系列稀釋度的Pep5稀釋液。本專利技術的ELISA試劑盒在制備肝病進程相關的檢測試劑或試劑盒中的應用，具體 包括以下步驟1)包被取5-30 u L臨床血清，加入70 u L_95 u L包被液，置于96孔板中，4°C放 置過夜或37°C放置2小時；同時加入100 u L包被液作為陰性對照；2)清洗棄包被液，用0. 01M、pH7. 4 PBST緩沖液200-300 y L清洗5-7次，拍干；3)封閉加入200-300 u L 5%的脫脂奶粉，37°C靜置封閉2小時；4)清洗棄封閉液，用0. 01M、pH7. 4 PBST緩沖液200-300 y L清洗5-7次，拍干；5)酶結合物加入80-120 uL HRP標記抗體，37°C靜置1小時；6)清洗棄抗體溶液，用0. 01M、pH7. 4 PBST緩沖液200-300 u L清洗5-7次，拍 干;7)顯色加入80-120iiL顯色液，37°C避光孵育15min顯色；8)終止加入30-70 u L 2M硫酸，終止反應；9)讀數用酶聯檢測儀測定波長450nm的光吸收值；10)判別以檢測0D值與陰性0D值之比大于2. 1為陽性。本專利技術中，術語“肝病進程”包括肝炎一肝纖維化一肝硬化一肝癌，肝纖維化是向 肝硬化發展的必由之路。針對上述技術方案，本專利技術具有以下優點和效果本專利技術中所闡述的多肽標志物Pep5定量檢測試劑盒不僅可以特異性檢測肝癌及 正常血清樣本，也能通過血清樣本中多肽標志物P印5的定量檢測，對肝病進程的發展進行 有效的監測。本專利技術所提供的單克隆抗體針對多肽標志物抗原的特異性強；多肽標志物抗原的 檢測方法的操作步驟簡便快捷，利于臨床檢測；可進行高通量、低成本的酶聯檢測儀檢測。附圖說明圖1為本專利技術所闡述的的多肽標志物P印5定量檢測試劑盒在肝病發展進程‘肝 炎_肝纖維化_肝硬化_肝癌’血清與正常血清的P印5含量差異的箱式圖。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。實施例1多肽標志物抗原單克隆抗體的制備方法1)采用偶聯載體蛋白KLH的合成的多肽5作為免疫原免疫BALB/C小鼠；其全長 序列為Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His_Gln。2)2周后檢測尾血滴度，達到1 :1000以上后，取BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0小鼠 骨髓瘤細胞在PEG作用下進行融合；3)通過ELISA方法進行篩選，用有限稀釋法對分泌抗體陽性的雜交瘤細胞進行克隆純化；4)篩選出10株針對合成肽5的雜交瘤細胞，意外地發現其中一株敏感性較高(lng/well)，擴增細胞系，制備并純化單抗腹水，檢測單抗的效價(1:200000)、滴度 (O. 0005μ g/ml)及亞型鑒定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特異性單克隆抗體。將該雜交瘤細胞株命名為抗人原發性肝癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株，并于2011年9月27 號在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏號為CGMCC No. 5269。實施例2 P印5定量檢測ELISA檢測試劑盒的組裝(1)1. 25 μ g/ml辣根過氧化物酶標記的實施例1的抗Pep5的特異性單克隆抗體；(2)包被液0.1M ρΗ9· 6的碳酸鹽緩沖液；(3)封閉液5g/100ml脫脂奶粉；(4 )顯色液過氧化氫/TMB顯色液；(5)終止液2M硫酸;(6)校準品/質控品系列稀釋度0_24ng/ml的P印5稀釋液；(7) 96孔酶聯板。實施例3多肽標志物抗原的ELISA檢測方法樣本臨床確診的肝炎血清50份、肝纖維化血清30份、肝硬化血清、肝癌血清103 份、正常血清160份。 檢測過程(I)包被5 μ L臨床血清,加入95 μ L包被液,置于96孔板中，4°C放置過夜；同時相應空中加入校準品及質控品；(2)清洗棄包被液，用O. 01M、pH7. 4 PBST緩沖液200 μ L清洗6次，拍干；(3)封閉加入300 μ L5%的脫脂奶粉，37°C靜置封閉2小時；(4)清洗棄封閉液，用O. 01M、pH7. 4 PBST緩沖液200 μ L清洗6次，拍干；(5)酶結合物加入100 μ L辣根過氧本文檔來自技高網...

【技術保護點】
保藏號為CGMCC?No.5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105在制備肝病進程相關的檢測試劑或試劑盒中的應用。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：魏開華，肖漢族，孫云波，傅海媛，侯利平，黃亞娟，宋純艷，楊保安，甄蓓，徐淑芳，張拓，王東茂，周曉明，原劍，
申請(專利權)人：北京正旦國際科技有限責任公司，湖南金健藥業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：