本發明專利技術提供了一種多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒，所述檢測試劑盒含有經酶標記的由保藏號為CGMCC?No.5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。本發明專利技術所提供的由所述雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體制備的檢測試劑盒可用于檢測腸腺癌，操作步驟簡便快捷，有利于高通量地臨床檢測，而且檢測成本低。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及ELISA檢測技術，具體地說，涉及一種多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測 試劑盒。
技術介紹
結腸癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發病率占胃腸道腫瘤的第3位。近年隨 著人民生活水平的提高和飲食結構的改變，其發病率呈逐年上升趨勢，嚴重地威脅著人類 健康。結腸癌常用的診斷方法有大便潛血檢查、鋇劑造影、結腸鏡檢查和血清腫瘤標志物 (tumor markers, TM),前兩種方法敏感性較低,結腸鏡檢查為侵入性檢查,較多患者難以接 受。TM檢測在癌癥篩查、診斷和治療后隨訪、復發的檢出和預后判斷中發揮著重要作用。早 期大腸癌患者預后較好，但患者常無臨床癥狀，診斷率很低。因此，篩選和建立用于癌癥早 期診斷的、高敏感、高特異的血清學診斷技術，提供癌癥早期預警普查，具有重大意義，市場 前景可觀。目前國內外廣泛采用檢測血清中CEA、CA242來檢測結腸癌。CEA是一種糖蛋白抗 原，從結腸腺癌和胚結腸黏膜組織中分離得到，是常見的結直腸癌腫瘤標記物。由于內胚層 來源的惡性腫瘤如結直腸癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等均存在CEA異常表達，且CEA釋 放入體循環時先經門靜脈進入肝臟，而肝臟對CEA有降解作用，可影響其在外周血液中的 濃度，因此CEA診斷結直腸癌不具備特異性。CA242最早是從人結直腸癌細胞Colo205單 抗發現的，是一種唾液酸化的糖類抗原，與腫瘤局部宿主抗腫瘤免疫反應有關，機體免疫抑 制越明顯，血清CA242水平越高。研究者認為CA242更適用于胰腺癌和消化道惡性腫瘤尤 其是結直腸癌的診斷。血清中豐富的多肽資源在目前重大疾病診斷中發揮著重要作用。采用目前常規的 臨床手段進行多肽檢測逐漸引起學術界和醫藥界的高度重視，基于多肽的腫瘤診斷技術正 開始向臨床應用高速發展，腫瘤的早期預警技術也在開發之中，一些多肽的聯合應用有可 能為腫瘤等重大疾病的預警提供革新性的突破。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種多肽標志物P印5酶聯免疫檢測試劑盒。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒，所述 檢測試劑盒含有經酶(優選辣根過氧化物酶)標記的由保藏號為CGMCC No. 5269的單克隆抗 體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。優選地，所述檢測試劑盒還含有包被液、封閉液、清洗液、顯色液、2M硫酸、終止液 和固相反應板中的一種或多種。更優選所述顯色液為TMB顯色液。其中，以多妝標志物Pep5 抗原(序列 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-A rg-Asp-Gln-Gly-Hi s-Gly-Hi s-Gln的多肽，命名為P印5)與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH) 的偶聯物免疫原，免疫BALB/C小鼠，然后篩選出的雜交瘤細胞株。本專利技術提供的抗多肽標志物P印5的單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105(S卩，抗人原發性肝癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105)現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址 北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2011 年9月27日，保藏號為CGMCC No. 5269。本專利技術還提供利用上述檢測試劑盒定量檢測腸腺癌血清中多肽標志物P印5方法，包括如下步驟將待測血清與包被液包被過夜，清洗若干次，采用封閉液進行封閉，清洗若干次，加入酶標記的多肽抗體，清洗若干次，顯色液顯色，加入終止液進行終止，檢測 0^450 值。其中，HRP標記的單克隆抗體與血清樣品中的多肽標志物P印5抗原發生特異性結合，并用顯色液顯色。具體步驟如下I)包被取5-30 μ L待測血清，加入70 μ L-95 μ L包被液，置于96孔板中，4°C放置過夜或37°C放置2小時；同時加入100 μ L包被液作為陰性對照；2)清洗棄包被液，用O. 01M、pH7. 4PBST緩沖液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；3)封閉加入200-300 μ L 5%的脫脂奶粉，37°C靜置封閉2小時；4)清洗棄封閉液，用O. 01M、pH7. 4PBST緩沖液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；5)酶結合物加入80-120 μ L HRP標記抗體，37°C靜置I小時；6)清洗棄抗體溶液，用O. 01M、pH7. 4PBST緩沖液200-300 μ L清洗5-7次，拍干；7)顯色加入80-120yL顯色液，37°C避光孵育15min顯色；8)終止加入 30-70 μ L 2M硫酸，終止反應；9)讀數用酶聯檢測儀測定OD45tlnm的光吸收值；10)判定以檢測OD值與陰性OD值之比大于等于2.1為陽性。本專利技術所提供的單克隆抗體針對多肽標志物Pep5抗原的特異性結合強；多肽標志物Pep5抗原的檢測方法的操作步驟簡便快捷，利于臨床檢測；可進行高通量、低成本的酶聯檢測儀檢測。本專利技術將多肽抗體與ELSIA技術聯合，可以同時檢測多個生物標志群，并可用于大規模的樣本檢測，是驗證血清標志物和應用于臨床檢測的理想工具。附圖說明圖1為本專利技術實施例5中將本專利技術的多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒應用于腸腺癌血清與正常血清的ROC曲線圖。具體實施方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例1多肽標志物抗原單克隆抗體的制備方法I)采用偶聯載體蛋白KLH的合成的多肽5作為免疫抗原免疫BALB/C小鼠；其中， 多妝 5 全長序列為Asn-Leu_Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。2)2周后檢測尾血滴度，達到1 :1000以上后，取BALB/C小鼠脾細胞與SP2/0小鼠 骨髓瘤細胞在PEG作用下進行融合；3)通過ELISA方法進行篩選，用有限稀釋法對分泌抗體陽性的雜交瘤細胞進行克 隆純化；4)篩選出10株針對合成肽5的雜交瘤細胞，意外地發現其中一株敏感性較 高(lng/孔)，擴增細胞系，制備并純化單抗腹水，檢測單抗的效價(1:200000)、滴度 (0. 0005ug/ml)及亞型鑒定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特異性單克隆抗體。將該雜交 瘤細胞株命名為抗人原發性肝癌多肽標志物單克隆抗體雜交瘤細胞株AP0105，并于2011 年9月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏號為CGMCC No.5269。實施例2結腸癌ELISA檢測試劑盒顯色液的研究1)過氧化氫-TMB顯色液底物液A中過氧化氫(H202)體積濃度為0. 3^2% ；2)過氧化氫-TMB顯色液顯色液B中四甲基聯苯胺(TMB)質量濃度為0. 2^1% ；3)過氧化氫-TMB顯色液顯色液A中緩沖液體系為醋酸緩沖液體系、檸檬酸緩沖 液體系。實施例3結腸癌ELISA檢測試劑盒顯色液的研究1)過氧化脲-TMB顯色液底物液A中過氧化脲體積濃度為0. 3^2% ；2)過氧化脲-TMB顯色液顯色液B中四甲基聯苯胺(TMB)質量濃度為0. 2 1%0 ；3)過氧化脲-TMB顯色液顯色液B中有機相DMF/DMS0比例實施例4多肽標志物抗原的ELISA檢測方法樣本臨床確診的腸腺癌血清本文檔來自技高網...
【技術保護點】
多肽標志物Pep5酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒含有經酶標記的由保藏號為CGMCC?No.5269的單克隆抗體雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：魏開華，肖漢族，孫云波，傅海媛，侯利平，黃亞娟，宋純艷，楊保安，甄蓓，徐淑芳，張拓，王東茂，周曉明，原劍，
申請(專利權)人：北京正旦國際科技有限責任公司，湖南金健藥業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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