快速檢測(cè)微量百菌清的試紙條制造技術(shù)

本實(shí)用新型專利技術(shù)涉及一種快速檢測(cè)微量百菌清的試紙條。該試紙條底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中纖維素膜層上有用偶聯(lián)百菌清的載體蛋白溶液印制的檢測(cè)印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG（或羊抗兔IgG）抗體溶液印制的對(duì)照印跡。金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的百菌清單克隆抗體或多克隆抗體。偶聯(lián)百菌清的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。本實(shí)用新型專利技術(shù)的試紙條特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡(jiǎn)便，直觀，準(zhǔn)確，檢測(cè)成本低，適用范圍廣，易于推廣應(yīng)用。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本技術(shù)涉及一種檢測(cè)微量抗菌類藥物的器具，特別是涉及一種快速檢測(cè)微量百菌清的試紙條。
技術(shù)介紹
百菌清(chlorothalonil, CTN),化學(xué)名稱為2，4, 5, 6_四氯-1，3_苯二腈，分子式為C8N2Cl4，分子量為265. 91，是一種高效的非內(nèi)吸性廣譜有機(jī)氯殺菌劑，對(duì)多種作物的真菌病害有良好的預(yù)防作用，被廣泛應(yīng)用于蔬菜、果樹(shù)、豆類、水稻、小麥、森林等多種作物的病害防治，工業(yè)上用作防霉涂料添加劑。因?yàn)榘倬鍖?duì)植物體具有良好的黏著性，導(dǎo)致百菌清及其代謝產(chǎn)物在果蔬、土壤及水中均有較大殘留，直接對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成嚴(yán)重危害。同時(shí)百菌清對(duì)魚(yú)類和兩棲動(dòng)物也有較大的毒性，能使水生生物、兩棲生物發(fā)生遺傳性突變。百菌清在自然界中的主要代謝物質(zhì)之一 3-羥基-2，4，5-三氯間苯二腈(TPN-OH),其毒性是母體毒性的30倍，其移動(dòng)性和持久性也遠(yuǎn)大于母體，它的毒性正引起人們的重視。我國(guó)2010年新頒布的《食品中百菌清等12種農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定，番茄和黃瓜中百菌清的最大殘留限量為5mg/kg，據(jù)報(bào)道，35種在蔬菜上常檢出超標(biāo)的農(nóng)藥中，百菌清的檢出超標(biāo)次數(shù)列第8位。因此急需建立一種快速、靈敏、有效的百菌清殘留檢測(cè)方法。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)百菌清殘留的方法主要采用理化分析方法，包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(LC/MS)、氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析法(GC/MS)等，這些方法檢測(cè)百菌清需經(jīng)一系列復(fù)雜的處理凈化過(guò)程，繁瑣費(fèi)時(shí)，從樣品預(yù)處理到得出檢測(cè)結(jié)果至少需要2天時(shí)間，同時(shí)需要大型專門(mén)的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員操作，無(wú)法現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，時(shí)效性較差。免疫學(xué)檢測(cè)法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測(cè)物的初步信息，該法靈敏度較高，分析過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，用作百菌清的篩查有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測(cè)技術(shù)，但目前百菌清免疫學(xué)快速檢測(cè)方法在國(guó)內(nèi)外尚屬空白，急待研究解決。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便的快速檢測(cè)微量百菌清的試紙條。本技術(shù)的技術(shù)方案—種快速檢測(cè)微量百菌清的試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設(shè)有偶聯(lián)百菌清的載體蛋白印制的檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體印制的對(duì)照印跡，所述金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗百菌清單克隆抗體或多克隆抗體。所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標(biāo)抗體纖維層用吸附百菌清的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成。所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。所述偶聯(lián)百菌清的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為平行排列的“ I I ”直線式印跡，或?yàn)椤笆弊中团帕杏≯E，或?yàn)椤癟 T”字型排列印跡，或?yàn)椤皝A丄”字型排列印跡，或?yàn)椤?h卜，，字型排列印跡，或?yàn)椤弊中团帕杏≯E。在吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層和吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上偏向吸附纖維層一側(cè)O. 3 O. 7cm處印制有樣品標(biāo)記線。本技術(shù)的試紙條具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本技術(shù)試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵形成，二者通過(guò)異性電荷 間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對(duì)單克隆抗體的特異性及親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，檢測(cè)試紙條具有較強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度，可檢測(cè)到納克級(jí)的微量百菌清。本技術(shù)在保障食品安全、保護(hù)消費(fèi)者健康方面具有極其重要的意義。φ簡(jiǎn)便、快速。使用本技術(shù)的試紙條，無(wú)需其它任何試劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作。只需將試紙條插入被檢樣品中10 20秒，取出后5分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。S:結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。試紙條以顯示棕紅色“ I ”(或“十”、“”)印跡作為檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“ I ”印跡，表示被檢樣品中含有百菌清，顯示兩條棕紅色“ I I ”印跡，表示被檢樣品中不含百菌清。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性等人為誤判。φ節(jié)省費(fèi)用。使用該檢測(cè)試紙條，無(wú)需另配儀器設(shè)備和其它試劑，可隨時(shí)隨地進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)用低廉，能節(jié)省大量貴重儀器和設(shè)備費(fèi)用。使用該檢測(cè)試紙條，每份樣品僅需人民幣3 5元，比用通常的儀器分析(每份樣品300元左右)和進(jìn)口 ELISA試劑盒(每份樣品30元左右)的費(fèi)用大幅下降。:f;適用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。本技術(shù)的檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)便，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、養(yǎng)殖戶以及消費(fèi)者個(gè)人等，具有廣闊的市場(chǎng)前景和明顯的經(jīng)濟(jì)效益以及社會(huì)效益。附圖說(shuō)明圖I為百菌清試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為百菌清試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式要制成快速檢測(cè)微量百菌清試紙條，首先制備偶聯(lián)百菌清載體蛋白和百菌清金標(biāo)抗體，從而制備隱形檢測(cè)印跡和金標(biāo)抗體纖維層；其次制備羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體，用于制備隱形對(duì)照印跡。(I)百菌清載體蛋白偶聯(lián)物抗原的制備采用羰基二咪唑法，將百菌清與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，制備人工結(jié)合抗原。稱取百菌清IOmg和氟化鉀3mg溶入400μ1乙二醇溶液中(加入氟化鉀能使乙二醇更易與百菌清反應(yīng)，取代百菌清分子上的6位氯原子，得到半抗原羥基百菌清(CTN-0H))，加熱至90 100°C，磁力攪拌反應(yīng)24 30h ;反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入到5g冰水中，將產(chǎn)生的沉淀分離并風(fēng)干，得白色固體即百菌清衍生物CTN-OH (羥基百菌清)；用400μ N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解百菌清衍生物，并加入4mg N，N-羰基二咪唑(⑶I)，磁力攪拌反應(yīng)3h,然后加入含IOmg載體蛋白BSA(半抗原和載體蛋白分子的摩爾比為200 300: 1，載體蛋白可用相同摩爾數(shù)的OVA或KLH替代)的PBS溶液(PBS溶液濃度為O. Olmol/L, pH=7. 4左右),攪拌反應(yīng)過(guò)夜；用PBS透析3天,然后離心,棄沉淀,得到百菌清的載體蛋白偶聯(lián)物，分裝并保存于-20°C，備用。(2)抗百菌清單克隆抗體或多克隆抗體的制備單抗制備用制備的百菌清載體蛋白偶聯(lián)物以2(^g 5(^g/只的用量免疫6 8周齡Balb/C小鼠3 4次，每次免疫間隔時(shí)間3 5周，確定抗體效價(jià)符合要求后進(jìn)行超強(qiáng)免疫，并在融合之前檢測(cè)其抑制價(jià)，之后3 4天將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽(yáng)性血清；脫頸致死，用75%的酒精浸泡小鼠5 IOmin消毒體表，無(wú)菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)120目尼龍紗布過(guò)濾，IOOOrpm離心lOmin，收集脾細(xì)胞。將I X IO8的脾細(xì)胞與NSO骨髓瘤細(xì)胞按10:1的比例混合，IOOOrpm離心IOmin棄上清，將細(xì)胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加 入O. 7 I. OmL的50%PEG4000, Imin內(nèi)加完，前30秒加O. I O. 3mL，中間15秒加O. 2 O. 4mL，最后15秒加完；然后緩緩加入無(wú)血清164本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種快速檢測(cè)微量百菌清的試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，其特征是：吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設(shè)有偶聯(lián)百菌清的載體蛋白印制的檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體印制的對(duì)照印跡，所述金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗百菌清單克隆抗體或多克隆抗體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種快速檢測(cè)微量百菌清的試紙條，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，其特征是吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設(shè)有偶聯(lián)百菌清的載體蛋白印制的檢測(cè)印跡，還設(shè)有用羊抗或兔抗小鼠IgG、或羊抗兔IgG抗體印制的對(duì)照印跡，所述金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗百菌清單克隆抗體或多克隆抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標(biāo)抗體纖維層用吸附百菌清的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄧瑞廣，職愛(ài)民，胡驍飛，邢廣旭，王玲玲，張改平，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類型：實(shí)用新型
國(guó)別省市：