編碼人肝活素的基因、載體、轉(zhuǎn)基因細胞和它們的應(yīng)用及人肝活素的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物工程領(lǐng)域，具體公開了一種編碼人肝活素的基因，該基因具有SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列。另外，本發(fā)明專利技術(shù)還公開了含有該基因的載體和轉(zhuǎn)基因細胞，以及它們在制備用于預(yù)防和/或治療肝損傷的藥物中的應(yīng)用，還涉及一種人肝活素的制備方法。本發(fā)明專利技術(shù)提供的新的編碼HPS的基因，能夠在宿主細胞中高效表達HPS，有效避免多聚體沉淀的形成，并且得到的HPS對肝損傷具有良好的療效，如能夠有效促進肝細胞的增殖、抗肝損傷、降低肝損傷組織轉(zhuǎn)氨酶水平以及組織肝細胞壞死。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
編碼人肝活素的基因、載體、轉(zhuǎn)基因細胞和它們的應(yīng)用及人肝活素的制備方法
本專利技術(shù)涉及生物工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種編碼人肝活素的基因，含有該基因的載體和轉(zhuǎn)基因細胞，以及它們在制備用于預(yù)防和/或治療肝損傷的藥物中的應(yīng)用，還涉及一種在細胞中，尤其是在哺乳動物細胞中以高水平產(chǎn)生人肝活素的方法。
技術(shù)介紹
我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，根據(jù)現(xiàn)有調(diào)查推算，我國有1.3億人攜帶乙肝病毒，3800萬人攜帶丙肝病毒，全國每年發(fā)生急性病毒性肝炎約120萬例，每年死于肝病者約30萬人。其中重癥肝炎、急性肝功能衰竭等有著起病急、預(yù)后差、病死率高的特點，臨床尚缺乏有效的治療手段。“阻止肝細胞壞死，促進肝細胞再生”仍然是主要的治療策略，其預(yù)后也主要取決于病損肝細胞的壞死程度和再生能力，這一原則后面的科學(xué)問題是肝損傷修復(fù)的分子機制。一些低等動物比如壁虎的尾、蠑螈的肢等，海參甚至全部的內(nèi)臟都可以再生，但是高等動物尤其是哺乳動物組織再生能力非常有限，然而肝臟卻是為數(shù)不多的具有強大再生能力的器官之一。肝臟至少承擔(dān)著5000種以上的生理功能，是人體最重要的器官之一。雖然正常肝組織中處于有絲分裂狀態(tài)的肝細胞僅占0.0012％-0.01％，但是肝臟的增殖能力和適應(yīng)代謝變化需求的能力并未喪失。肝臟具有很強的損傷修復(fù)能力，當(dāng)肝臟被部分切除或肝細胞受到破壞(如中毒、缺血、缺氧、病毒感染)時，剩余的肝細胞迅速進入分裂周期，通過強大的再生能力迅速修復(fù)損傷的肝組織，例如，鼠類在進行70％肝切除后在8-10天即可恢復(fù)正常肝臟大小。尋找阻止肝細胞壞死，促進肝細胞再生的藥物一直是研究的熱點，而基于肝再生的特點，從肝臟本身尋求治療嚴重肝病的有效物質(zhì)一直是人們夢寐以求的愿望，尤其是特異性的作用于肝臟的細胞增殖因子更是人們重點研究目標(biāo)之一。早在七十年代LaBrecque等即報道在哺乳動物再生肝中存在一種特異性促肝增殖的細胞活性因子——肝細胞刺激物質(zhì)(HepaticStimulatorySubstance，HSS)，隨后研究表明該因子廣泛存在于哺乳動物幼仔的肝、胚胎肝及再生肝組織中。80年代我國學(xué)者陳成偉等應(yīng)用4-6月人胎肝細胞懸液(h-FLCS)治療肝功能衰竭并獲得較好療效，從而推動了此項研究在國內(nèi)的開展應(yīng)用。肝損傷的修復(fù)機制十分復(fù)雜，細胞因子、生長因子、免疫系統(tǒng)、代謝網(wǎng)絡(luò)等共同參與其中。肝臟受到損傷后，一方面表現(xiàn)為肝細胞的凋亡或壞死，機體在感知損傷后，相應(yīng)的代謝、免疫等系統(tǒng)會發(fā)生相應(yīng)的變化以適應(yīng)新的情況；另一方面表現(xiàn)為肝細胞的增殖，損傷后，一些即刻早期基因(immediateearlygenes)如c-fos，c-jun等表達迅速升高，同時誘導(dǎo)枯否(氏)細胞、巨噬細胞等產(chǎn)生包括TNF-α在內(nèi)的炎性細胞因子，進而激活產(chǎn)生NF-κB、IL-6、STAT3等，細胞由G0期進入G1期；此外，TNF-α還刺激產(chǎn)生TGF-α，協(xié)同其它生長因子比如HGF、EGF等促使細胞由G1期進入M期。在肝細胞增殖的過程中，細胞因子、生長因子起到關(guān)鍵的作用，它們通過相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，相互作用，不僅啟動而且維持肝的再生過程。目前已知能夠促進肝細胞分裂的物質(zhì)很多，主要包括兩大類：細胞分裂素類和輔有絲分裂生長因子類，前者包括肝細胞生長因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)、肝細胞生成素(hepatopoietin，HPO)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-α)等等，后者包括去甲腎上腺素(Norepinephrine)、雌激素(Estrogens)、胰島素(Insulinum)和胰高血糖素(Glucagon)等。比如在肝再生過程中，HGF由肝非實質(zhì)細胞合成分泌，作用于肝實質(zhì)細胞膜上的特異受體c-Met而刺激肝細胞DNA合成，HGF和c-Met形成的旁分泌途徑調(diào)控肝細胞的生長和分化；HPO在肝臟中存在自分泌循環(huán)，通過肝細胞表面的特異受體啟動MAPK通路促進肝細胞的增殖；TGF-α以自分泌的形式為肝細胞提供促有絲分裂刺激物，而EGF則以內(nèi)分泌的形式促進肝細胞的分裂。但上述各種生長因子對肝細胞的刺激作用都是非特異性的。以HGF為例，研究表明，HGF作用的靶細胞非常廣泛，生物學(xué)作用多種多樣如負向調(diào)控腫瘤細胞的增殖，促進非肝細胞再生與腎、胃、腦等組織損傷修復(fù)，正向調(diào)控造血，促進胚胎與多種器官發(fā)育，促進腎細胞等運動等。肝再生具有很強的器官特異性，尋找肝臟特異性的刺激因子對于深入認識肝再生的分子機制有重要意義，并可能為嚴重肝病治療提供新藥物。2000年，Hara等通過差減cDNA克隆和爪蟾卵母細胞表達篩選方法從大鼠肝臟中獲得一種新的促肝細胞生長因子——Hepassocin(HPS，也稱為人肝活素)。次年，人源性HPS也被克隆。序列檢索表明人源性HPS與HFREP1(Hepatocyte-DerivedFibrinogen-RelatedProtein1)高度同源。HFREP1是FGL1基因表達產(chǎn)物，而FGL1(Fibrinogen-like1)是Yamamoto等于1993年通過差減雜交方法篩選到的一種基因，其表達產(chǎn)物HFREP1屬于纖維蛋白原家族。纖維蛋白原和纖維蛋白原相關(guān)蛋白C端具有4個保守的半胱氨酸殘基，HFREP1同纖維蛋白原β、γ的C末端同源——包含4個半胱氨酸，但缺少纖維蛋白凝血形成所必需的血小板結(jié)合位點、交聯(lián)區(qū)和凝血酶敏感位點，故Yamamoto推測該蛋白是一種與血液凝固不相關(guān)的分泌蛋白。2002年，JunYAN等在小鼠中發(fā)現(xiàn)了鼠HPS的同源蛋白MFREP-1(mousefibrinogen-relatedprotein-1)，2004年，JunYAN等又獲得了人LFIRE-1(liverfibrinogen-relatedgene－1)，而LFIRE-1是HPS和HFREP1的同源基因，因此JunYAN又將其命名為LFIRE-1/HFREP1基因，LFIRE-1/HFREP1基因與HFREP1基因具有相同的閱讀框架(OpenReadingFrame，ORF)，只是在5’非翻譯區(qū)有些不同，并且發(fā)現(xiàn)LFIRE-1/HFREP1是一種肝臟特異性表達的基因，該基因在肝癌細胞中表達下調(diào)同時還具有抑制肝癌細胞生長的特性。人Hepassocin基因位于染色體8p22-p21.3，由8個外顯子組成，mRNA長度為1.2kb，ORF全長936bp，編碼312個氨基酸的多肽，其中N末端22個氨基酸為其信號肽序列。人HPS多肽與HFREP1蛋白只有3個氨基酸位點的不同，即Asn69，Ile72，Leu105，而HFREP1則分別為Asp69，Val72，Pro105。鼠HPScDNA為1.4kb，蛋白多肽全長314個氨基酸，其中N末端24個氨基酸為其信號肽序列。人HPS與鼠HPS蛋白的同源性在切除信號肽前為81.4％，而切除信號肽后為83.8％。人HPS蛋白多肽單體為34kDa，內(nèi)含有5個半胱氨酸殘基，并且加入還原劑后HPS促肝增殖活性消失。Westernblot結(jié)果也顯示HPS存在34kDa和68kDa兩種天然形態(tài)，故此推測HPS在體內(nèi)以同源二聚體的形式發(fā)揮作用。HPSmRNA在正常的大鼠肝臟中有低的表達，而當(dāng)肝切除或D－氨基半乳糖做致?lián)p傷時，HPSmRNA本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種編碼人肝活素的基因，其特征在于，該基因具有SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種編碼人肝活素的基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。2.一種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權(quán)利要求1所述的基因和表達載體。3.一種轉(zhuǎn)基因細胞，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因細胞含有權(quán)利要求1所述的基因。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因細胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細胞為真核細胞。5.權(quán)利要求1所述的編碼人肝活素的基因、權(quán)利要求2所述的重組載體或權(quán)利要求3或4所述的轉(zhuǎn)基因細胞在制備人肝活素中的應(yīng)用。6.一種人肝活素的制備方法，其特征在于，該方法包括：在編碼人肝活素的基因能夠表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3或...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊曉明，于淼，翟華立，吳帆，李長燕，詹軼群，陳慧，史世領(lǐng)，史世會，張全義，呂中原，王緒陽，
申請(專利權(quán))人：北京正旦國際科技有限責(zé)任公司，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，河南新鄉(xiāng)華星藥廠，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11