本發明專利技術具體涉及一種鑒定西瓜枯萎病的InDel分子標記及其引物和在西瓜抗枯萎病育種中的應用。該InDel分子標記的核苷酸序列為：TTTATTTTTTATTTTTTATTT，其引物序列：InDel1_fon1F：TTCCAAAAGTGCAGATTTC；InDel1_fon1R：CACATGGGGATTGACTAAG。本發明專利技術通過QTL初定位同樣在1號染色體定位到了抗fon1的主效QTL，并結合親本重測序制備到與西瓜枯萎病抗性緊密連鎖的InDel分子標記及其引物和在西瓜抗枯萎病育種中的應用，可為西瓜枯萎病抗性提供新手段，加速西瓜枯萎病抗性性狀的改良進程，提高育種的準確性和選擇效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學領域，具體設及一種鑒定西瓜枯萎病的InDel分子標記及 其引物和應用。
技術介紹
枯萎?。ɑ痵ariumwilt,FW)，由半知菌亞口鑲抱屬菌西瓜?；停╢on)寄生引 起，是世界范圍內西瓜生產中導致產量和品質降低最嚴重的一種真菌±傳病害。目前，已報 道的fon生理小種有0、1、2和3共四種，除了化n3,不同的商業西瓜品種在一定程度上已經 整合了生理小種化nO、化nl和化n2的抗性。但是，大部分品種不抗枯萎病，病菌能夠在西 瓜種植區很快的擴散和蔓延。因此，開發與枯萎病抗性緊密連鎖的易于操作、成本低廉的分 子標記，不僅可W在苗期快速鑒定抗枯萎病品種/系，縮短育種周期，還有利于改良西瓜的 枯萎病抗性，為西瓜抗病育種提供技術支撐。 最近，Lambel等（2014)利用SNP標記定位了一個西瓜化nl抗性的主效的'L位 點，位于1號染色體遺傳圖譜的2. 3~8. 4cM，對應于1號染色體物理圖譜的56050~ 6541994bp。許勇課題組也根據SNP位點開發了與化nl緊密連鎖的兩個CAPs/dCAPs標記， 分別為7716_fon和502124_fon，對應于1號染色體物理圖譜的459624和502124bp，并且 502124_fon與化η1連鎖的程度更緊密些。 現有的已開發的西瓜化nl抗性緊密連鎖的分子標記為CAPS/dCAPs標記，檢測過 程需要酶切，成本較高，步驟繁瑣。基于全基因組重測序的插入/缺失（InDel)標記為共顯 性標記，檢測容易，成本低廉，但尚存在一些不如意之處，如變異較少、穩定性不夠等。
技術實現思路
本專利技術通過QTL(quantitativetraitlocus,數量性狀基因座)初定位在1號染 色體定位到了抗化nl的主效的1，并結合親本重測序制備到與西瓜枯萎病抗性緊密連鎖的 InDel分子標記及其引物和在西瓜抗枯萎病育種中的應用，可為西瓜枯萎病抗性提供新手 段，加速西瓜枯萎病抗性性狀的改良進程，提高育種的準確性和選擇效率。 為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案如下： 設計一種鑒定西瓜枯萎病的InDel分子標記，其核巧酸序列為：TTTATTTTTTATTTTTTATTT〇 上述InDel分子標記的引物，包括W下的核巧酸序列： InDell_fonlF：TTCCAAAAGTGCAGATTTC； InDell_fonlR:CACATGGGGATTGACTAAG。鑒定西瓜枯萎病的InDel分子標記的篩選方法，包括w下步驟： (1) 利用母本"ZXG01478"(高抗枯萎病)和父本"14CB11"(高感枯萎病)雜交的F2群體 構建高密度的遺傳連鎖圖譜，并對父母本、Fi和F2群體的93個單株進行枯萎病抗性鑒定； (2) 結合遺傳連鎖圖譜和枯萎病抗性鑒定，可利用WinQ化cartographer2. 5 software化ttp: //statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)進行QTL初定位，在LGl鑒 定到一個枯萎病抗性相關的的'L位點化nl，其LOD峰值為26. 05,解釋80. 18%的表型變異， 置信區間對應的物理位置為1號染色體的193331~277557化P; (3) 結合兩個親本的重測序，在QTL區間發現19個插入缺失片段大于20bp的InDels， 為了縮小候選基因的范圍，進一步把的'L區域劃分為5段，根據位于端點位置的插入缺失設 計InDel分子標記，設計對應的InDel引物； (4) 利用對應的InDel引物在父母本、Fi和F2群體中進行基因型鑒定； (5) 加上InDel分子標記的基因型鑒定結果與LG1上的其他SNP標記利用JoinMap4. 0 進行圖譜構建，并利用WinQTLcartogra地er2. 5software進行QTL的重新掃描；結果顯 示其中一個分子標記，InDell_fonl出現在該QTL的峰點，并且L0D值為31. 65,解釋91. 46% 的表型變異，Q化置信區間對應的物理位置同樣為1號染色體的193331~277557化P。 利用上述技術措施，申請人最終獲得了與西瓜枯萎病抗性緊密連鎖的插入缺失標 記InDell_fonl，其對應的西瓜參考基因組物理圖譜的位置為1號染色體的464377bp，序列 為TTTATTTTTTATTTTTTATTT，引物序列為， InDell_fon1F:TTCCAAAAGTGCAGATTTC; InDell_fonlR:CACATGGGGATTGACTAAG。 標記位點InDell_fonl對應的LOD值為31. 65,解釋91. 46%的表型變異。 上述鑒定西瓜枯萎病的InDel分子標記在西瓜枯萎病抗性育種中的應用方法，包 括如下步驟： (1) 對F2群體的93個單株利用所述分子標記InDell_fonl進行基因型鑒定； (2) 利用上述（1)分析結果根據分子標記InDell_fonl的基因型對不同單株進行分 類，并利用枯萎病抗性鑒定數據進行鑒定和驗證。 本專利技術具有W下積極有益的技術效果： 本專利技術InDel分子標記變異穩定、檢測容易，不需要酶切等繁瑣的步驟，并且成本低 廉(相對于已開發的CAPS/dCAPs標記)，提高了西瓜枯萎病抗性育種的選擇效率和準確 率，從而最大限度的加快育種進程；此外，此標記位于的'L的峰值，解釋很大的表型貢獻率 (91. 46%)，加快了西瓜枯萎病抗性基因的克隆和功能驗證。【附圖說明】圖1F2群體的枯萎病抗性鑒定結果分布圖。 圖2篩選InDell_fonl分子標記前后giL掃描結果比較。字體加粗和下劃線的是 QTL化nl的峰值位置分子標記尤虹omosomel上加粗的標記是新篩選的InDel分子標記。 [001引圖3利用分子標記InDell_hnl的引物在部分F2群體基因組DNA中的擴增結果。 父母本方框中條帶為目的條帶。名稱皆為品種名稱\代號的后兩/Ξ位。 圖4利用分子標記hn_7716的引物在部分F2群體基因組DNA中的擴增結果。父 母本方框中條帶為目的條帶。名稱皆為品種名稱\代號的后兩/Ξ位?！揪唧w實施方式】為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，W下結合具體實施例，對本 專利技術進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用w解釋本專利技術，并不用于 限定本專利技術。W下實施例中所設及的原料，如無特別說明均為市售，所設及檢測方法如無特 別說明，則均為常規方法。[001引 實施例1 西瓜枯萎病抗性鑒定，具體步驟如下： (1) 菌±的準備：將菌種從溫箱培養的西瓜枯萎病植株上分離培養，使用前用麥粒擴繁 培養后與滅菌沙±按1 :50比例混合均勻，備用； (2) 種子準備：每品種取種100粒，室溫浸種24小時，33°C催芽36小時播種； (3) 接種鑒定：采用麥粒沙菌±法，將準備好的菌±用營養鉢裝好，溫室內加溫苗床播 種，每營養鉢5粒，兩次重復，設感病和抗病對照和保護行； (4) 病情調查：播種10天后開始發病，記載出苗和發病情況，4周左右待感病和抗病對 照品種分別達到預期病級后，最后一次統計各品種的活苗數，計算病情； (5) 病情計算方法： 死苗率（％)=(出苗數一活苗數）/出苗數X100%; (6) 抗病性分級本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鑒定西瓜枯萎病的InDel分子標記，其核苷酸序列為：TTTATTTTTTATTTTTTATTT。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李娜，尚建立，馬雙武，王吉明，李楠楠，
申請(專利權)人：中國農業科學院鄭州果樹研究所，
類型：發明
國別省市：河南;41
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