本發明專利技術公開一種靶向DNA四面體納米探針及其制備和應用，將標記有Cy5的DNA單鏈以及另外三條具有特定堿基序列的DNA鏈加入到Tris-MgCl2溶液中混合、反應，得DNA四面體即TDN；將上述DNA四面體溶液和一定濃度的腫瘤穿透肽溶液混合，利用click反應，合成靶向DNA四面體，即靶向TDN；步驟三、將上述靶向DNA四面體溶液加入到濃縮離心管，離心去除反應液中殘存的小分子，再將沉淀物重懸在TM?buffer?（10mM?Tris?base、50mM?MgCl2、pH=8）中，即可得到DNA靶向納米探針。將Cy5熒光分子修飾在DNA四面體上，同時連接靶向多肽，使得該探針具有靶向和體內近紅外成像的功能。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術提出一種靶向DNA四面體納米探針的近紅外成像的制備及應用，具體涉及將標記有特定焚光分子的DNA單鏈，自組裝成DNA四面體，并進一步修飾上腫瘤穿透肽，從而實現具有腦腫瘤靶向性檢測的DNA四面體納米探針。
技術介紹
目前所存在的針對腫瘤檢測的納米探針主要有以下幾類:基于磁性材料的納米探針，這類納米探針主要以鐵或鐵的化合物為基體；基于納米金及其復合物的檢測探針；以及基于其他無機納米材料，如碳納米管及其復合物的納米探針等。這類物質通常具有一定的生物毒性，組織相容性較差，代謝困難。因此，制備一種新型的安全的納米檢測探針就成為了當務之急。已有研究將DNA材料作為探針用于腫瘤檢測，通過靶分子與腫瘤細胞表面的特異性受體相結合，提高納米探針的靈敏度(中國專利技術專利:一種檢測腫瘤納米探針的制備方法，公開號:CN102234679A ;中國專利技術專利:基于納米探針直接檢測肺癌樣品中P53基因突變的方法，公開號:CN101392286A)。將DNA四面體材料納米探針用于靶向腫瘤的近紅外檢測，不僅生物相溶性好，無細胞毒性，而且熒光分子以及一些短肽類小分子能夠很容易的修飾在DNA鏈上，這就為DNA靶向納米探針的構建提供了理論基礎。同時，由于堿基的精確配對，DNA材料能夠自組裝成具有一定結構尺寸的三維構型，通過調控納米結構的尺寸以及腫瘤穿透肽的修飾，該納米探針能夠更加容易到達腫瘤部位并清晰成像，具有較高的研究意義和應用價值。
技術實現思路
針對現有技術在腫瘤檢測中的不足，本專利技術的目的在于提供一種對腦腫瘤具有靶向作用的納米探針的制備方法及其應用。該方法通過在DNA鏈上修飾能夠被近紅外激發的熒光分子，再設計特定的堿基序列，使DNA鏈能夠在一定條件下自組裝成DNA四面體，并進一步修飾腫瘤穿透肽，以增強其穿透性和靶向性。本專利技術采用DNA材料作為分子探針的基體，具有非常好的生物相容性，配合腦腫瘤穿透肽，能夠有效地穿透腫瘤外圍組織進入到腫瘤內部，在腦部腫瘤檢測領域具有廣闊的應用前景。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的: 一種靶向DNA納米探針的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一、將標記有Cy5的DNA單鏈以及另外三條具有特定堿基序列的DNA鏈加入到Tris-MgCl2溶液中混合、反應，得DNA四面體即TDN ； 步驟二、將上述DNA四面體溶液和一定濃度的腫瘤穿透肽溶液混合，利用click反應，合成靶向DNA四面體，即靶向TDN ； 步驟三、將上述靶向DNA四面體溶液加入到濃縮離心管，離心去除反應液中殘存的小分子，再將沉淀物重懸在TM buffer (10mM Tris base、50mM MgCl2、pH=8)中，即可得到DNA靶向納米探針。步驟一中所述DNA單鏈為可通過堿基互補配對自組裝成DNA四面體三維構型的DNA單鏈；所述DNA單鏈的濃度為50 μ M，序列包括如TDN-1、TDN_2、TDN-3、TDN_4所示的序列；所述序列TDN-3后續可以用Cy5等熒光標記，TDN-4后續可以用N3標記。步驟一中所述Tris-MgCl；^.#液含 10mM Tris、50mM MgCl 2、pH=8 的水溶液。步驟一中所述反應具體為:在PCR儀中，反應溫度為95°C，10分鐘后快速冷卻至4°C，繼續反應30分鐘。步驟一中所述DNA四面體最終濃度為2 μ M。步驟二中為保證click反應充分進行，所述DNA四面體溶液和靶肽溶液中靶肽的摩爾量大于DNA四面體；進一步地，所述DNA四面體和靶肽的摩爾比為1:2。步驟二中所述反應溶液中，PBS溶液(磷酸緩沖溶液)的pH為7.3，0.1 mM的CuS04水溶液，TCEP (三(2-羧乙基)膦)溶液為0.1mM水溶液，TBTA (叔丁基三氯乙酰亞胺酯)溶液為含10 μ Μ TBTA的DMS0 (二甲基亞砜)溶液。步驟二中，所述恒溫反應的條件具體為:37°C、175rpm震蕩5小時；步驟三中所述離心采用的轉速為6000rpm，采用的離心管為超濾管(0D010C35, 10k, PALL, USA)，離心的目的是去除反應液中的殘存的小分子。—種靶向DNA納米探針，其特征在于，根據上述任一所述方法制備得到。一種靶向DNA納米探針作為腦腫瘤靶向DNA納米探針在近紅外成像的應用。由于DNA四面體的小尺寸和較好的生物相容性，本專利技術在腫瘤檢測領域有較大的應用前景。與現有技術相比，本專利技術具有如下優點: 1、本專利技術采用DNA材料，通過設計不同的堿基序列，可以實現多種DNA三維結構，并能精確調控該納米探針的尺寸和構型。2、本專利技術將靶向性小分子與熒光分子同時引入DNA材料中，使得納米探針能夠兼具尋革E能力和成像的能力。3、本專利技術使用的DNA材料，具有非常好的生物相容性，避免了因為納米探針聚集可能造成的腦部功能區的損害?！靖綀D說明】通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本專利技術的其它特征、目的和優點將會變得更明顯: 圖1為DNA靶向納米探針電泳圖(L2為單鏈DNA，L3為雙鏈DNA，L4為修飾前的DNA四面體，L5-L8為修飾上不同腫瘤穿透肽的DNA四面體)； 圖2為DNA靶向納米探針粒度圖(Ds為雙鏈DNA，TDN為靶肽修飾前的DNA四面體，P-TDN為腫瘤穿透肽修飾的DNA四面體)； 圖3為DNA靶向納米探針體外細胞激光共聚焦圖； 圖4為DNA材料活體成像圖(從左往右以此是對照組，DNA雙鏈組，DNA四面體組，靶向性DNA四面體組)?！揪唧w實施方式】下面結合具體實施例對本專利技術進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本專利技術，但不以任何形式限制本專利技術。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本專利技術構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本專利技術的保護范圍。實施例1: 步驟一:各取 2 μ L 單鏈 DNA (50 yM)TDN-l、TDN-2、Cy5-TDN-3、N3-TDN-4 加入到 42 μ LTris-MgCl2 (Tris 10mM, MgCl2 50mM, pH8)溶液中。將混合溶液置于PCR儀中，反應溫度為95°C，10分鐘后快速冷卻至4°C，繼續反應30分鐘。DNA單鏈即可通過堿基互補配對自組裝成DNA四面體三維構型。步驟二:取 180 μ L 的 PBS 溶液(ρΗ7.3)，40 μ L 的 CuS04水溶液(0.1mM)，40 μ L 的TCEP水溶液(0.1mM)以及40 μ L的TBTA溶液(10 μ M，DMSO溶解)配成反應液。取100 μ L制備好的TDN溶液(2 μ Μ)和200 μ L氨基酸序列為RGERPPR的靶肽溶液(2 μ Μ)加入到上述反應液中，37 °C恒溫175rpm震蕩5小時后，反應完成。步驟三:將上述反應液加入到超濾管(0D010C35，10k, PALL, USA)中，6000rpm離心去除游離的離子，并將離心后的沉淀物重懸于100 yL的TM buffer中，重懸后，該DNA靶向納米探針的濃度為2 μΜ。反應產物的電泳和粒度數據分別見圖1和圖2。圖3為體外細胞激光共聚焦實驗，驗證了該納米探針具有良好的靶向性。實施例2: 步驟一:各取 2 μ L 單鏈 DNA(50 yM本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種靶向DNA納米探針的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟一、將標記有Cy5的DNA單鏈以及另外三條具有特定堿基序列的DNA鏈加入到Tris?MgCl2溶液中混合、反應，得DNA四面體即TDN；步驟二、將上述DNA四面體溶液和一定濃度的腫瘤穿透肽溶液混合，利用click反應，合成靶向DNA四面體，即靶向TDN；步驟三、將上述靶向DNA四面體溶液加入到濃縮離心管，離心去除反應液中殘存的小分子，再將沉淀物重懸在TM?buffer?（10mM?Tris?base、50mM?MgCl2、pH=8）中，即可得到DNA靶向納米探針。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：何丹農，王萍，夏智偉，劉婷，金彩虹，
申請(專利權)人：上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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