本發(fā)明專利技術(shù)公開了靶向基因DNA分子探針的制備方法，其將網(wǎng)路生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)和實驗室分子生物學(xué)有機的結(jié)合起來，通過使用網(wǎng)路的或計算機的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)工具，來確定人類基因組中疾病基因序列或正常基因序列，剔除其中的非特異的重復(fù)DNA片斷，保留獨特的和特異的疾病基因序列或者基因組特有的正常基因序列。整個DNA探針制作過程包括兩大程序：第一程序是將基因的DNA序列確定并排除非特異性重復(fù)片段，第二程序是在第一程序的設(shè)計和指導(dǎo)下，應(yīng)用實驗室分子生物學(xué)的手段將此DNA探針實際地制造出來。本發(fā)明專利技術(shù)制造的探針可用于在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織和細胞切片以及細胞涂片的臨床病理標(biāo)本上進行以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的原位雜交反應(yīng)包括熒光原位雜交和非熒光的顯色原位雜交，用于各級各類疾病基因的檢測和診斷，還可用于正常人類基因和非人類基因的測定。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)
，涉及將基于計算機的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)和實驗室分子生物學(xué)結(jié)合起來以制備靶向基因DNA分子探針的方法。
技術(shù)介紹
人類基因組測序工程于1990年正式啟動，經(jīng)過多個國家的數(shù)百名科學(xué)家和工程技術(shù)人員的共同努力，于2001年發(fā)表了初稿，并于2006年最后完成，歷時十六年，耗資上百億美元。這一工程的完工，將第一個也是最重要的一個哺乳動物，即我們?nèi)祟愖约旱恼麄€基因組的圖譜展現(xiàn)在我們眼前，其中包括所有22對常染色體(1-22)和兩個性染色體(X，Y)的DNA序列，共計大約32億核苷酸堿基。同時揭示人類蛋白質(zhì)編碼的基因大約有二萬至二萬五千個，其核苷酸序列的總長度僅占整個基因組長度的1.9%。這些基因不均等地分散分布在基因組的各個角落，參見圖I。此外，占基因組絕大部分的堿基是一些有序或無序的重復(fù)序列，有些重復(fù)序列具有明顯的規(guī)律，比如，5-8個堿基循環(huán)出現(xiàn)構(gòu)成到100-200個堿基的集團，然后這個集團又在不同的基因組中出現(xiàn)，由于此類DNA堿基可以在任意(無規(guī)律)基因組DNA中出現(xiàn)，如圖2，因此，如果所制作的進行雜交的DNA分子探針中含有此類重復(fù)序列，則信號會在所有染色體基因或細胞中出現(xiàn)，所得結(jié)果就被混淆，這類雜交信號即被稱為干擾信號或背景信號。因此，如何去除這些重復(fù)片段，成為一個問題。隨著人類基因組測序工程的完成以及后基因組時代的到來，生物醫(yī)學(xué)的科學(xué)研究和技術(shù)發(fā)展進入了一個前所未有的新時期，這對醫(yī)療保健的發(fā)展和進步提供了空前的機遇，對生物醫(yī)學(xué)高科技的研究和應(yīng)用也提出了巨大的挑戰(zhàn)。生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究也不再是一個獨立的概念，而是時時刻刻都與醫(yī)療保健相關(guān)聯(lián)。如何將基礎(chǔ)研究的成果用于臨床？如何開展具有明確醫(yī)藥用途的科學(xué)研究即基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化性的研究(transitionalresearch) 是目前每一位生物醫(yī)學(xué)研究人員都在考慮的問題。由于基因的異常與多種疾病都相關(guān)，例如腫瘤，心血管疾病，遺傳病，中樞神經(jīng)退行性疾病，視網(wǎng)膜黃斑變性，血液病，代謝營養(yǎng)性疾病，自體免疫性疾病，內(nèi)分泌性疾病如糖尿病，等等。另外，對于傳染性疾病，如病毒，細菌感染，也要研究其基因結(jié)構(gòu)，表達方式及蛋白產(chǎn)物，才能深刻地理解疾病的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，才能進行更好的治療，又如愛滋病(人類免疫缺陷病毒，Human immunodeficient virus, HIV),乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV),結(jié)核病(tuberculosis, TB)等等。在疾病的診斷上，用基因及其產(chǎn)物進行診斷，包括腫瘤(人類基因)和感染性疾病(微生物基因)，已顯現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。其結(jié)果更加準(zhǔn)確，迅速，安全，可靠?；蛟\斷亦稱分子診斷，是由人類基因組序列工程與其它致病性病源微生物和病源體的基因序列弄清楚以后所衍生出來的診斷領(lǐng)域，其歷史雖然不長，已顯示出強大的生命力。其發(fā)展速度非常快，其范圍也囊括幾乎所有醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前臨床上已在使用的，以感染性疾病，腫瘤及心血管疾病最多。其中腫瘤病理學(xué)的“分子診斷”是一個重要的分支。根治腫瘤仍然是一世界性難題，但針對致癌基因的“靶向治療”是目前最有效的腫瘤治療戰(zhàn)略之一。配合靶向治療的“伴侶診斷”是目前國際上最新的腫瘤分子診斷方法。它通過對疾病分子標(biāo)志物進行檢測，對靶向治療中病人的篩選及預(yù)后的觀察起關(guān)鍵性作用。在過去的60年里，有關(guān)DNA的技術(shù)層出不窮，使得對DNA的檢測成為可能，比如于1969年專利技術(shù)的熒光原位雜交(FISH)技術(shù)(Gall and Pardue，PNAS 1969)，1972年專利技術(shù)的分子克隆技術(shù)(Cohen, Chang and Hsu, PNAS 1972)以及 1985年專利技術(shù)的PCR技術(shù)(Saiki RK etal, Science 1985; Jeffreys, Wilson and Thein, Nature 1985)等等。此外，伴隨人類基因組測序工程的進展，為了能夠充分的分析，研究，分享和應(yīng)用DNA序列的成果，計算機軟件及基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)得到了很好的開發(fā)。比如，1990年專利技術(shù)的基礎(chǔ)局部搜索DNA同源序列的工具-比較基因組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)BLAST (Altschul SF et al, J. Mol. Biol. 1990)和2002年開始運行的UCSC基因組瀏覽器(Kent WJ and Colleagues, Genome Res. 2002)，都是很好的研究應(yīng)用工具。這使得任何研究人員都能夠再次利用并開發(fā)和發(fā)展DNA序列，并將其用到實際應(yīng)用當(dāng)中。本專利技術(shù)的靶向基因DNA分子探針的制備方法就是在分析，比較和應(yīng)用以上這些技術(shù)的基礎(chǔ)上誕生的。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供將基于計算機的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)和實驗室分子生物學(xué)結(jié)合起來來制作具有特異性序列的DNA分子探針的方法，制備出的DNA分子探針能夠與整個靶向基因的所有特異性DNA序列進行DNA-DNA雜交，起到準(zhǔn)確探測、識別疾病基因和正常基因的作用。DNA分子探針的制備方法包括兩大程序_6] 第一程序利用基于計算機的生物信息學(xué)手段來獲得靶向基因的特異性DNA序列，并設(shè)計出相應(yīng)PCR引物第一程序包括以下步驟(I)在公共基因庫上搜索到靶向基因的基因組位置，然后識別出該靶向基因的編碼序列和非編碼序列(即外顯子和內(nèi)含子的區(qū)域)，剔除掉其中的非特異性重復(fù)序列，獲得覆蓋整個靶向基因的特異性DNA序列，該特異性DNA序列為不連續(xù)的多個DNA片段；位于外顯子的編碼序列一般都是特異性序列，即該基因所特有的(在少數(shù)情況下，有些基因的外顯子編碼序列也會與其同一家族的其它基因序列有非常大的同源性，應(yīng)有所注意，在設(shè)計探針時因避免使用)。位于內(nèi)含子的非編碼序列又分成特異性序列和非特異性序列，前者是該基因所特有的，在制作探針時應(yīng)當(dāng)保留，后者一般由有序或無序的重復(fù)DNA序列構(gòu)成，在制作DNA探針時應(yīng)當(dāng)去除。下面列出的一些重復(fù)序列，在基因組的許多基因內(nèi)含子的區(qū)域中都存在，應(yīng)當(dāng)避免用在探針里。重復(fù)序列I : tgaatttcccagcctccagaactatgggaaataaatttctgttgtttacaagtaaatcattttatgttattttgttacagaagcccaaaaagatgaagacatacaccagatcactccattctcttcttgcttgcatggtttctgaggatacgttggatgtaattctaatattctctataggtattttctttatggctcct重復(fù)序列2 aagctccagtatacctaaacaagtgcaaatttgtttaagtacagttatttgtggtagcattagtcattgttttcaatagcaagaagaaaaaggaaacaac重復(fù)序列3 catcaaaaatcggttaccataaaatcctaatagttgaagagatgtaatttcaattatttggtaaacctgaccttcattgtcaaagc重復(fù)序列4 ttttcctgtgtctctgcaaccacaggcccctctcctttctcttaataaagataccagtcattgagtttgaaaattgctaagagagtctgttgtaaatctt重復(fù)序列5 cttagcacaaaaaaaaatgacagatatgtga本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于：包括第一程序，其利用基于計算機的生物信息學(xué)手段來獲得靶向基因的特異性DNA序列，并設(shè)計出相應(yīng)PCR引物；第二程序，其根據(jù)第一程序的設(shè)計應(yīng)用分子生物學(xué)手段來制造DNA分子探針；所述第一程序包括以下步驟：（1）在公共基因庫上搜索到靶向基因的基因組位置，然后識別出該靶向基因的編碼序列和非編碼序列，剔除掉其中的非特異性重復(fù)序列，獲得覆蓋整個靶向基因的特異性DNA序列，該特異性DNA序列為不連續(xù)的多個DNA片段；（2）給靶向基因的特異性DNA序列中每一個DNA片段設(shè)計出成對PCR引物，引物長度為18?25個堿基；所述第二程序包括以下步驟：（1）以正常組織的基因組DNA為模板，利用第一程序的步驟（2）中設(shè)計出的PCR引物，用PCR方法擴增出第一程序的步驟（1）中確定的靶向基因的特異性DNA序列，擴增出的特異性DNA序列含有靶向基因的所有特異信息；（2）利用擴增出的特異性DNA序列制造特異性的DNA分子探針，該DNA分子探針能夠與整個靶向基因的所有特異性DNA序列進行DNA?DNA雜交。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：方園，
申請(專利權(quán))人：張家港藍蘇生物工程有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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