本發明專利技術公開一種豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒及其制備方法，通過酵母表達的TTSuV1ORF1a重組蛋白包被抗原制備、標準陽性血清和標準陰性血清篩選、確定抗原包被濃度和血清稀釋度、試劑盒的組裝等步驟建立TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒，用于檢測豬血清中TTSuV1抗體水平。TTSuV1ORF1a重組蛋白可以競爭性抑制血清中抗體與固相包被抗原的結合，本發明專利技術的試劑盒對TTSuV1抗體的特異性較好，試劑盒批內和批間的最大變異系數（CV）分別為6.87%和11.4%，均低于行業標準的15%，使試劑盒具有很好的重復性和穩定性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及獸醫
，具體涉及一種豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒及其制備方法，建立TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒用于檢測豬血清中TTSuVl的抗體水平。
技術介紹
輸血傳播病毒(TransufsionTransmitted Viurs,TTV)是一類無囊膜，二十面體，單股負鏈環狀DNA病毒，電鏡觀察病毒顆粒直徑約為30 -32nm。TTV首次由日本學者從一例未知病原的非甲一非戊型輸血后肝炎病人的血清中發現，隨后人們在非靈長類以及豬、牛、羊、犬，貓、家禽等多種家養及野生動物體內也發現了 TTV的感染。2009年，國際病毒分類協會(ICTV)將豬的TTV劃分到指環病毒科(Anelloviridae)細環病毒屬(Iotatorquevirus),細環病毒屬進一步劃分為兩個種；豬I型細環病毒(Torque teno sus virus I , TTSuVl)和豬I型細環病毒(Torque teno sus virus II,TTSuV2)。作為一種較為新型的病毒，TTSuV2的致病機理知之甚少。2004年，McKeown對中國，愛荷華州，泰國，安大略，韓國，西班牙，魁北克和薩斯喀徹溫省這六個不同國家地區的154份豬血清進行檢測，TTSuV2陽性率可高達66. 2%(102/154)。Aramouni等證實了 TTSuVl與斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)之間有一定的聯系并發現TTSuV2與其他已知的豬病原體協同感染可以導致疾病加重。近年來，關于TTSuVl和TTSuV2的報道逐漸增多，TTSuV2的感染具有廣泛性和普遍性，這一特點引起了諸多科研工作者的關注。因此，加強對TTSuV2的流行病學調查，確定其抗原性點，對TTSuV2的防治有十分重要的意義。目前，國內外對TTSuVl和TTSuV2的流行病學報道中，較為注重TTSuV2的感染情況，TTSuV2的感染似乎在增強PMWS和TONS病癥方面起著更為重要的作用，目前已經有報道建立了 TTSuV2抗體診斷的“阻斷ELISA法”。然而，在幾乎所有報道中，TTSuVl在豬血清中超過30%的檢出率(PCR方法)足以引起人們對TTSuVl危害的重視。國內外逐漸建立了TTSuVl病毒核酸診斷(PCR)的方法，尚無關于TTSuVl抗體診斷(ELISA)試劑盒的報道。
技術實現思路
為克服現有技術的缺陷，本專利技術的目的在于提供一種豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，建立的TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒具有良好的重復性和穩定性，可以檢測豬血清中TTSuVl的抗體水平。本專利技術的另一目的在于提供一種豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法。為實現上述目的本專利技術所采用的技術方案如下一種豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其包括用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被抗原包被的酶標板，以及用TTSuVl唯一結構蛋白ORFl作為免疫診斷抗原篩選出的標準陽性血清和標準陰性血清，其中用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白的序列為SEQ ID NO:1。本專利技術中，所述的豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其還包括1)HRP標記的兔抗豬二抗液兔抗豬二抗與HRP保護液按照體積比為1:2000-3000的比例稀釋，用量為100μ I ；2)抗體稀釋液0. 1%BSAL Og 加入 PBS 至 1000ml，用量為 100 μ I ；3)顯色液50mg TMB, IOmL DMSO, 9. 8g檸檬酸和1. 2ml 30%H202加蒸餾水定容至1000ml，用量為 100μ I ；4)終止液雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. 7mL混合，用量為100 μ I。 優選的方案中，上述豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒還包括pH 值為 7. 4,0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20,8. Og NaCl，0.2g KCl，0.5mL 0. 05% (V/V)Tween-20,加雙蒸水定容至100ml的洗脫液。作為一個優選的方案中，所述的豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒中，用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋包被抗原包被的酶標板的包被濃度為O. 25 I μ g/ml0一種豬I型細環病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟I)酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被抗原的制備a. TTSuVl ORFla序列獲取結合Genebank數據庫中TTSuVl序列信息,在病毒基因組序列保守區設計診斷引物SEQ ID N0:2和引物SEQ ID N0:3;應用rTaq DNA聚合酶PCR擴增目的片段，PCR擴增產物進行電泳，純化、測序獲得已測序列；然后在已測序列基礎上設計反向擴增引物SEQ ID N0:4和引物SEQ ID NO: 5，擴增包括TTSuVl ORFl全序列的病毒基因序列；應用LA TaqDNA聚合酶PCR反向擴增目的片段，對PCR擴增產物進行電泳，純化、獲得TTSuVl ORFla蛋白；b. TTSuVl ORFla的酵母表達應用Primer Premier5. O設計表達引物SEQ ID N0:6和引物SEQ ID N0:7，以TTSuVl陽性核酸為模板，應用Kod plus高保真酶的PCR反應，電泳、純化目的條帶后，雙酶切PCR產物及載體，連接，轉化E. col1:DH5a，提取重組質粒pPICZ a -TTSuVl ORFla, Sac I單酶切線性化；將酵母菌X-33制備成感受態細胞，取80 μ L感受態細胞與5 10 μ g線性化的重組表達質粒混合，轉入0. 2cm電轉杯，電轉化，電轉化后的菌液用Iml冰浴山梨醇10倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養基選擇平板上，置于30°C培養2 3d，在200-1000 μ g/ml濃度Zeocin的YPD平板上篩選具有高Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25ml BMGY培養基，于30°C培養至OD6tltlnm 4. O ;離心、收集菌體，用100ml BMMY培養基重懸培養,每日取樣Iml,并補加純甲醇于培養基至終濃度為0. 5%，誘導表達6d，取樣品離心收集上清作SDS-PAGE分析，以Ant1-HIS_antibody為第一抗體，Western Blotting篩選出步驟I) TTSuVl ORFla蛋白的高考貝子；c. TTSuVl ORFla純化取步驟2)中的篩選出的高考貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，溶解，應用親和層析的方法純化酵母表達系統表達的重組TTSuVl ORFla在PBS中透析后，應用BCA法進行定量，獲得酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白，序列為SEQ IDNO:1 ；2)標準陽性血清和標準陰性血清的篩選a.構建插入pET-21空載體的TTSuVl ORFl原核表達載體應用PrimerPremier5. O 設計引物 SEQ ID N0:8 和 SEQ ID N0:9，以 TTSuVl 陽本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于：其包括用酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白包被抗原包被的酶標板，以及用TTSuV1?ORF1作為免疫診斷抗原篩選出的標準陽性血清和標準陰性血清，其中用酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白的序列為SEQ?ID?NO:1。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李中圣，羅鈞，陳善真，趙焱，
申請(專利權)人：廣東現代農業集團研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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