一種檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)為檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的檢測。所述試劑盒包括：包被敵敵畏抗原的酶標(biāo)板、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品、敵敵畏抗體工作液、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒的原理是固相間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)，把提取的樣品、酶標(biāo)二抗工作液和抗體工作液加入對應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，孵育一段時(shí)間后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色，加入終止液，顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。顯色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中敵敵畏的含量成反比例關(guān)系。該方法可直接用于檢測農(nóng)作物中敵敵畏的殘留量。

ELISA kit for detecting dichlorvos and detection method thereof

The invention relates to an enzyme-linked immunoassay kit for detecting dichlorvos and a detection method thereof. The method is sensitive, accurate, rapid, simple in operation and strong in specificity, and is suitable for the detection of a large number of samples. The kit includes: coated antigen ELISA plate, dichlorvos DDVP standard, dichlorvos DDVP enzyme labeled antibody solution, two anti solution, substrate solution A, substrate liquid B, termination liquid, concentration dilution liquid and condensed washing liquid. The principle of detection of dichlorvos ELISA Kit ELISA is the solid state reactions of indirect competitive enzyme, the enzyme extracted from the samples, the standard two resistance of working fluid and the corresponding antibody was added to microtiter plate microporous, incubated for a period of time, wash the plate and adding substrate solution A, substrate solution B, chromogenic agent under the action of the enzyme showed blue, adding the stop solution, the color changed from blue to yellow. The depth of color is inversely proportional to the content of dichlorvos in the standard or sample. The method can be used to detect the residues of dichlorvos in crops.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及獸藥殘留檢測
，特別是檢測大米中敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒。
技術(shù)介紹
敵敵畏為廣譜性殺蟲、殺螨劑，用來防治棉蚜等農(nóng)業(yè)害蟲，也用來殺死蚊，蠅等。具有觸殺、胃毒和熏蒸作用。觸殺作用比敵百蟲效果好，對害蟲擊倒力強(qiáng)而快。純品為無色至琥珀色液體，微帶芳香味。制劑為淺黃色至黃棕色油狀液體，在水溶液中緩慢分解，遇堿分解加快，對熱穩(wěn)定，對鐵有腐蝕性。對人畜中毒，對魚類毒性較高，對蜜蜂劇毒。因此定期對敵敵畏殘留進(jìn)行檢測成為許多國家的監(jiān)控的必要手段。酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測行業(yè)。本專利技術(shù)旨在建立一種檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服色譜法的不足，本專利技術(shù)提供一種檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測。本專利技術(shù)檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品、敵敵畏抗體工作液、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。本專利技術(shù)檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標(biāo)板的制備、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品的制備、敵敵畏抗體工作液的制備、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。其進(jìn)一步特征在于：所述的酶標(biāo)板經(jīng)由敵敵畏抗原包被制備，具體步驟是將敵敵畏半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將敵敵畏包被抗原稀釋成1：40000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4℃條件下保存。敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。所述敵敵畏抗體工作液是采用敵敵畏人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。所述敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5%吐溫-20，0.1mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟：(1)預(yù)處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；(3)取包被有敵敵畏抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL/孔到對應(yīng)的微孔中，加入敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液，50μL/孔，然后加入敵敵畏抗體工作液，50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min；(4)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；(5)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15～20min；(6)加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值（請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）；(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中敵敵畏的含量。本專利技術(shù)檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法的測定原理：樣品中的敵敵畏與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中敵敵畏的含量。如果樣品中的敵敵畏含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本專利技術(shù)的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測。具體實(shí)施方式敵敵畏蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備：采用琥珀酸酐法得到帶羧基的敵敵畏半抗原衍生物，之后取0.05mmol與載體蛋白BSA按10：1的結(jié)合比混合在0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15mmol碳二亞胺，攪拌置室溫反應(yīng)24h，最后于0.2mol/LpH7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，將得到的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩硵澄房贵w的制備：選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原50μg與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進(jìn)行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進(jìn)行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價(jià)至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進(jìn)行末次免疫，3天后取脾制備脾細(xì)胞懸浮液與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆化，選擇處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時(shí)用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000rpm離心15min，收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進(jìn)行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浒挥袛硵澄钒豢乖拿笜?biāo)板：包被抗原是將敵敵畏半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將敵敵畏抗原稀釋成1:40000比例，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150μL/孔，37℃放置1.5h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4℃下保存。敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。敵敵畏抗體工作液的制備：采用敵敵畏人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，底物液A為含有0.5mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，終止液為2mol/L的硫酸，濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，濃縮洗本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，包括酶標(biāo)板、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品、敵敵畏抗體工作液、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。

【技術(shù)特征摘要】
1.檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，包括酶標(biāo)板、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品、敵敵畏抗體工作液、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。2.檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，包括以下步驟：酶標(biāo)板的制備、敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品的制備、敵敵畏抗體工作液的制備、敵敵畏酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其特征在于：所述的酶標(biāo)板制備方法為將敵敵畏半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到敵敵畏包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將包被抗原稀釋成1：40000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入稀釋后的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150μL/孔，37℃放置1.5h，棄去封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4℃條件下保存。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其特征在于：敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測敵敵畏的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，其特征在于：所述的敵敵畏抗體工作液是采用敵敵畏人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：洪霞，杜霞，立雯馨，
申請(專利權(quán))人：江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32