一種檢測伏馬毒素的熒光免疫試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種檢測伏馬毒素的時間熒光分辨熒光免疫分析試劑盒。所述檢測伏馬毒素的時間分辨熒光免疫分析檢測試劑盒是由多孔包被板、緩沖液、伏馬毒素標準品、伏馬毒素的抗體凍干品、銪標記的羊抗鼠抗體、洗滌液和增強液所組成。所述檢測伏馬毒素的時間熒光免疫分析試劑盒的檢測方法包括下列步驟：(1)免疫原的制備；(2)包被原的制備；(3)單克隆抗體的制備；(4)樣品的前處理及檢測。本發明專利技術檢測時間短、平均回收率高、樣品前處理簡單、能現場操作檢測，應用廣泛，檢測成本低，同時具有檢測特異性強，批內和批間差異小、靈敏度高和操作簡單快速，且特別適合于大批量樣品的檢測等優點。且特別適合于大批量樣品的檢測等優點。

【技術實現步驟摘要】
一種檢測伏馬毒素的熒光免疫試劑盒


[0001]本專利技術屬于生物檢測領域，具體的說，涉及一種檢測伏馬毒素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒。

技術介紹

[0002]伏馬菌素（FB）是一種霉菌毒素，是由串珠鐮刀菌產生的水溶性代謝產物，是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結構類似的雙酯化合物。主要污染糧食及其制品，可產生急性毒性反應及潛在的致癌性。相關實驗表明，對小鼠進行了伏馬毒素的毒理試驗，以50mg/kg體重水平飼養小鼠，18~26個月后，發現肝腫瘤患病率急劇上升，證明伏馬毒素可引發肝癌。
[0003]而時間分辨熒光免疫分析法（TR-FIA）由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對伏馬毒素檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻報道。

技術實現思路

[0004]為解決以上技術問題，本專利技術的目的在于提供一種蔬菜水果中伏馬毒素殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。
[0005]本專利技術的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測蔬菜水果中伏馬毒素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測農作物中伏馬毒素殘留量。
[0006]本專利技術目的之一是這樣實現的：檢測伏馬毒素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、伏馬毒素標準品溶液、抗伏馬毒素的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。
[0007]本專利技術目的之二是這樣實現的：檢測伏馬毒素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于：(1) 免疫原的制備：將半抗原伏馬毒素與牛血清白蛋白（BSA）偶聯，得到免疫原（伏馬毒素-BSA）；(2) 包被原的制備：將半抗原伏馬毒素與卵血清白蛋白（OVA）偶聯，得到包被原（伏馬毒素-OVA）；(3) 單克隆抗體的制備：a. 用步驟(1)的免疫原（伏馬毒素-BSA）免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗伏馬毒素的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；b. 以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗伏馬毒素的單克隆抗體IgG；c. 用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；(4) 樣品的前處理及檢測：取包被有包被原（伏馬毒素-OVA）的多孔包被板，加入50
?μ
L的伏馬毒素到各自的微孔
中，加50
?μ
L以緩沖液稀釋的抗伏馬毒素抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100
?μ
L Eu
3+
?-
兔抗鼠抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1小時，洗滌液洗6次，加200
?μ
L增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據標準曲線計算樣品中的伏馬毒素含量。
[0008]上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。
[0009]本專利技術主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測伏馬毒素。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面：第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗伏馬毒素的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗伏馬毒素的單克隆抗體IgG。第二，Eu
3+
標記抗體的制備。
[0010]本專利技術測定方法：測定的基礎是標記免疫反應。包被有伏馬毒素-OVA的多孔包被板，加入測試樣品到各自的微孔中，再加入抗伏馬毒素抗體，振蕩反應，游離的伏馬毒素與微孔板上的伏馬毒素-OVA競爭抗伏馬毒素抗體，洗滌液洗滌，沒有連接的伏馬毒素抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu
3+-兔抗鼠抗體,進行標記免疫反應，再用洗滌液洗滌，反應后沒有連接的Eu
3+-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強液振蕩后，在紫外燈的激發下發射很強的熒光，用時間分辨熒光儀測定其熒光強度cps，熒光強度與樣品中的濃度成反比，對照標準曲線即可確定樣品中伏馬毒素的量。
[0011]本專利技術檢測方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡單、能現場操作檢測，應用廣泛，該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
具體實施方式實施例
[0012]1、免疫原與包被原制備本專利技術免疫原（伏馬毒素-BSA）的合成：準確稱取伏馬毒素324mg溶解在2mL N,N-二甲基甲酰胺中，攪拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，攪拌反應3小時，調節反應液pH 10左右。離心除掉沉淀物。將上述反應逐滴加入BSA溶液中（320mg BSA溶解于5mL生理鹽水），再加入N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）23mg，N,N-二環己基碳二亞胺（DCC）45.4mg，4℃反應過夜，離心除去沉淀，取上清液用磷酸緩沖液（PBS）透析3天，每6小時更換透析液，將所得產物低壓凍干，于-20℃保存備用；包被原（伏馬毒素-OVA）的合成：在上述反應中，將BSA換成OVA后，得到反應偶聯物伏馬毒素-OVA，該偶聯物作為TR-FIA檢測時作為包被原使用。
[0013]2、單克隆抗體制備2.1動物免疫用步驟1制備的免疫原分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100
μ
g/0.2mL。首次免疫，用無菌0.01mol/L pH7.4 PBS溶解免疫原（伏馬毒素-BSA），再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，勁背部皮下分2～3點注射；加強免疫，用0.01mol/L pH7.4 PBS溶解免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14～21天，第3次免疫后7～10天開始對免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清，用ELISA檢測小鼠血清效價。末次免疫后間隔4周以上，在細胞融合前3～4天，腹腔注射伏馬毒素-BSA抗原100
μ
g/0.2mL/只，注射
后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態良好。
[0014]2.2單克隆抗體制備分離免疫小鼠的脾細胞，并進行勻漿制備免疫脾細胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精浸泡5min，進行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，再用鑷子撕開皮膚，露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪開一小口。換一套鑷子和剪刀，用剪刀剪開腹膜，露出脾臟，再換一套器械用鑷子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎培養基（RPMI-1640）于勻漿器中，進行研磨，擠壓出脾細胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補加適量基礎培養基（RPMI-1640），靜置2min，將上層細胞液吸取后，放入腹腔巨噬細胞離心管中，重復上述操作1次。1200r/min離心10min，除去上清。將108個免疫脾細胞與1～2
×
107個SP2/0骨髓瘤細胞按照1:10或1:5的比例加入離心管中，進行混勻，然后于1500r/min水平離心10min，棄去上清。將離心管倒本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種檢測伏馬毒素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于：由多孔包被板，緩沖液，伏馬毒素標準品，伏馬毒素的抗體凍干品，銪標記的羊抗鼠抗體，洗滌液和增強液所組成。2.一種根據權利要求1所述檢測伏馬毒素的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理，其特征在于：(1) 將伏馬毒素與牛血清白蛋白偶聯，得到免疫原；(2) 將伏馬毒素與卵血清蛋白偶聯，得到包被原；(3) 用步驟(1)的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗伏馬毒素的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；(4) 以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化，獲得抗伏馬毒素的單克隆抗體(5) 用步驟(2)的包被原包被固相載體；(6) 將動物組織先經過酸解提取后，再過MAX柱凈化，最后加入衍生試劑和催化劑進行處理，得到待測產物；(7) 將步驟(6)的待檢物進行測量熒光強度cps，對照標準曲線計算樣品中的伏馬毒素伏馬毒素含量。3.根據權利要求1所述檢測伏馬毒素的時間熒光免疫分析法...

【專利技術屬性】
技術研發人員：洪霞，杜霞，袁超，
申請(專利權)人：江蘇維賽科技生物發展有限公司，
類型：發明
國別省市：