人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體、其制備方法及應用技術

本發明專利技術提供了利用噬菌體表面展示技術篩選獲得的人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBIgG03(輕鏈和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示)和HBIgG12(輕鏈和重鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示)。所述抗體能夠特異性識別乙肝病毒表面抗原，可與乙肝病毒表面抗原發生顯著的酶聯免疫反應且具有抗乙肝病毒感染的中和活性功能。此外，可將本發明專利技術的抗體制成預防和治療乙肝病毒相關肝病的特異性抗體藥物，從而在臨床中用于預防和治療由乙肝病毒引起的肝病。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因工程抗體技術，具體地說，涉及人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體、其制備方法及應用。
技術介紹
乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是世界范圍內普遍存在的公共健康問題，急性乙型肝炎過后有5%-10%的持續HBV感染發展為慢性肝病，包括慢性活動性肝炎、肝硬化和原發性肝細胞癌。據估計全世界每年有500，000到1，000,000人死于與HBV有關的各種肝臟疾病。我國屬于肝炎大國，乙肝病毒攜帶率為人口的9. 75%。全世界乙肝病毒感染者4. 2億，我國約有I. 3億人攜帶乙肝病毒。乙肝病毒的傳播方式大致可分為垂直傳播和水平傳播兩大類。垂直傳播指HBV攜帶者母親對胎兒的傳播，絕大部分發生在妊娠的最后三個月。嬰兒一旦感染乙肝病毒，他們中85%-90%會發展成慢性帶乙肝病毒狀態，其中25%于成年后將死于肝硬化和肝癌。99年的研究顯示，我國乙肝病毒感染者也就是乙肝病毒攜帶者和慢性乙型肝炎中有80%-85%來源于父母在生殖生育過程中的感染。水平傳播可以概括為圍產期傳播、家庭內傳播、醫源性傳播和性傳播，而其中圍產期傳播較嚴重。關于慢性乙型肝炎的治療目前還沒有一個令人滿意的方法，對于肝功能有損害的病人通過保肝治療絕大部分可以使肝功能得到恢復，但要清除乙肝病毒卻是十分困難的。乙肝病毒慢性攜帶者更是如此。其原因主要是免疫耐受，也就是乙型肝炎病毒感染者的體內免疫系統對乙型肝炎病毒不能產生有效的清除作用。免疫耐受的原因是人體感染乙肝病毒的時間較早，普遍認為是在3歲以前感染的。尚未找到合適的治療方法之前，防止病毒感染就顯得十分重要。目前對于乙肝病毒的預防主要包括主動免疫和被動免疫兩種。主動免疫即注射乙肝疫苗，自70年代末首次出現血源性乙肝疫苗，經過幾十年的發展到現在已有了成熟的基因工程疫苗。乙肝疫苗的免疫效果好，是預防乙型肝炎傳播的有效手段之一。被動免疫為注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，主要用于阻斷母嬰傳播(與乙肝疫苗聯合使用)和意外事故的被動免疫。有研究表明采用乙肝疫苗聯合HBIG阻斷母嬰傳播效果優于單用疫苗者并且能減少慢性感染的比例。目前HBIG均來源于人抗-HbsAg的陽性血清，這就使其大量制備受到限制，同時由于來源于血清所以容易發生血源性傳播疾病的感染。正如血源性疫苗向基因工程疫苗的轉變，現在也亟待開發出基因工程乙肝表面抗體替代血源性HBIG，噬菌體抗體庫技術為這一問題的解決另辟踐徑。利用含有特異性抗體的人源或動物血清免疫球蛋白來預防和治療傳染病由來已久。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內保護肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實驗的證明，如鼠抗甲肝病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體內100%保護動物免受病毒攻擊。以抗原免疫動物獲得多抗血清的途徑一直是獲得抗體的經典方法，但缺乏特異性和均一性。繼而建立的B淋巴細胞雜交瘤技術使得眾多科學家通過細胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb),其特異性強，性質均一，易于大量生產。然而McAb多為鼠源性，鼠源McAb的異源性反應極大地限制了 McAb作為治療制劑在人體的應用。免疫球蛋白(Vaccinia immune globulin, VIG)作為抗體成分主要來自捐獻者(恢復期病人)免疫血清,從獲得陽性血清到通過安全性檢測均需花費大量的人力和財力，這就使其大量制備受到限制，同時由于來源于血清所以容易發生血源性傳播疾病的感染。而使用人源基因工程產品替代血制品則可克服這些缺陷，隨著人源基因工程抗體研究的不斷深入，給這一領域的生物制品發展帶來了新的希望和廣闊前景。通過基因水平上抗體分子的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對單克隆抗體的研究有了突破性進展并越來越顯示出其重要意義及實際運用前景。80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術興起和整個基因工程抗體技術研究領域的發展 ，使當今世界人源或基因工程抗體的開發研究取得很大進展，并已由基礎研究階段步入實質性應用研究和開發階段。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預防和治療帶來了新的希望，在抗病毒感染生物藥領域逐漸形成了一類新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(Antibody Drug)。正如血源性疫苗向基因工程疫苗的轉變，現在也亟待開發出基因工程抗體替代血源性VIG，如通過嵌合抗體技術(Boulianne, G. L.等，1984;Morrison, S. L.等，1984)、人源化抗體技術(Jones, P.T.等，1986)、攜帶人單抗的轉基因小鼠技術(Green，L.L.等，1994)、異體雜交瘤技術(James, K. et al.，1987)、曬菌體表面展示技術(Barbas, C. F.等，1991)等產生人源化抗體,現已成為國內外研究的熱點，并正在逐步獲得成功。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體及其活性片段。本專利技術的另一目的是提供編碼所述抗體或其活性片段的基因。本專利技術的另一目的是提供所述人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體的制備方法。本專利技術的再一目的是提供所述人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體的應用。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBFab03或其活性片段，其輕鏈高變區⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重鏈高變區⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如表I所示表I抗體HBFab03的重鏈及輕鏈高變區的氨基酸序列CDRlCDR2CDR3重鏈VH SITGSSYY IYSTSGTT ARPTAHRNVRMVPGQDAFEV輕鏈VL QSVDSSR DASQQYASAPDT前述的抗體HBFab03，i)其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經替換、或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；例如，將第7位的Gly替換為Ala，或是將第17位的Ala替換為Val，或是在28位缺失Asp均不會影響蛋白的功能；以及ii)其重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第6位的Gly替換為Asp，或是將第38位的Thr替換為Ala均不會影響蛋白的功能。本專利技術還提供編碼所述抗體HBFab03的基因。其中，編碼輕鏈可變區和編碼重鏈可變區的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。本專利技術的一種人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBFabl2或其活性片段，其輕鏈高變區⑶R1XDR2和⑶R3以及重鏈高變區⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列如表2所示表2抗體HBFabl2的重鏈及輕鏈高變區的氨基酸序列CDRlCDR2CDR3重鏈VH SITGSSYY IYSTSGTT ARPTAHRNVRMVPGQDAFEV輕鏈VL QSVSSTY GASQQYGYSPLT 前述的抗體HBFabl2，i)其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；例如，將第 位的Gly替換為Ala，第17本文檔來自技高網...

【技術保護點】
人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBFab03或其活性片段，其特征在于，其輕鏈高變區CDR1、CDR2和CDR3以及重鏈高變區CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如下表所示：

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁米芳，畢勝利，孫麗娜，郭瑜，劉洋，張福順，李川，李德新，
申請(專利權)人：中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，
類型：發明
國別省市：