本發明專利技術涉及免疫分析醫學領域，具體地提供了一種基于免疫磁顆粒的化學發光分析方法檢測人膀胱癌細胞的試劑盒及其制備方法。根據本發明專利技術，本發明專利技術的試劑盒主要包括：1)膀胱癌EJ細胞標準品；2)由特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體包被的磁顆粒；3)酶標記的特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體；4)3)中的酶所作用的化學發光底物；5)反應管或微孔板；6)與5)中的反應管或微孔板配套的磁分離器。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及免疫分析以及臨床診斷醫學領域，具體地，本專利技術提供一種人膀胱癌細胞的化學發光檢測試劑盒及其制備方法。
技術介紹
膀胱癌是泌尿系統中最常見的腫瘤。血尿是膀胱癌患者臨床早期癥狀之一，有肉眼血尿和鏡檢血尿。然而血尿在尿路炎癥以及結石癥狀下也有發生，并不是膀胱癌的特異性癥狀。正是由于膀胱癌早期癥狀不明顯，以至于發現有血尿，患者膀胱腫瘤一般發展為較大的腫瘤結節。尋找特異的膀胱癌診斷方法對早期膀胱癌診斷有重要的臨床應用價值。膀胱癌的早期診斷方法有以下幾種I)尿液分析血尿出現后的首先便是進行尿液分析，以便排除是否是由于尿路炎癥引起，并不能確定患者是否患膀胱癌；2)尿脫落細胞分析對尿沉渣中的尿脫落細胞進行顯微鏡下觀察，可以鑒別并區分惡化的腫瘤細胞和正常細胞。但靈敏度不高，早期膀胱癌容易被漏檢；3)超聲、CT或者MRI成像觀察對腫瘤的大小和惡化程度可以直接進行圖像觀察，準確度較前面方法大大提高。盡管近年來成像技術的不斷進步，靈敏度不斷提高，但對較小的腫瘤觀察仍然不夠，易漏檢；4)膀胱鏡觀察膀胱鏡通過尿路進入膀胱，進行膀胱內可視觀察，從而發現早期的腫瘤。能夠檢出2)、3)中漏檢的大部分患者。目前早期診斷膀胱癌細胞特異性最高的是通過膀胱鏡的觀察，熒光膀胱鏡的應用提高了檢測靈敏度。但患者一般需要臨床跟蹤觀察，從而能及早發現腫瘤發生或復發狀況。然而，膀胱鏡觀察會對患者造成身體不適。另外，目前熒光膀胱鏡檢測所需熒光染料特異性不高，且對人體有一定的負面影響。因此，在膀胱癌的早期診斷方面，人們一直在探索更特異、靈敏的檢測方法，盡可能的利用特異的腫瘤標志物實現方便、快速的檢測。實現尿樣中的膀胱癌標志物或者細胞的檢測，進行實時檢測在臨床診斷方面具有重要的應用價值。目前商業化的可用的膀胱癌的標志物有人補體因子H相關蛋白(膀胱腫瘤抗原，BTA試劑盒)、高分子量的癌胚抗原和兩個膀胱癌細胞相關的粘附分子(美國Scimedx Corp公司的Immunocyt試劑盒)、核基質蛋白22 (NMP22)、3、7和17號染色體的異倍體以及P16腫瘤抑制因子9p21位點的缺失(UroVysion試劑盒)。BTA是指人補充因子H相關蛋白，BTA檢測需要專業操作人員在標準實驗室進行，靈敏度達到57-83 %，特異性60-92%，血尿患者的特異性只能達到46%。另外良性前列腺增生、腎結石以及尿路感染等情況均影響BTA檢測的特異性；Immunocyt試劑盒通過免疫熒光檢測尿脫落細胞，盡管靈敏度以及特異性很高，但為了達到較高的準確性需要進行大量的尿脫落細胞檢測，因此在膀胱癌病人的治療以及預后觀測方面具有很高的應用價值，但應用在早期診斷方面差強人意；其中NMP22是目前應用最廣的膀胱癌標志物，ELISA試劑盒的市場化實現了膀胱癌早期診斷的方便、快捷檢測，檢測靈敏度和特異性也很高，但是在有病毒感染、腎/膀胱結石等情況下，仍會出現假陽性；UroVysion試劑盒采用的是多祀標的突光原位雜交(FISH)技術，盡管靈敏度與特異性得到極大提高，美國FDA批準，但與Immunocyt試劑盒類似，需要檢測大量的尿脫落細胞。結合目前的膀胱癌標志物的應用以及膀胱癌的診斷現狀得出一方面，新的特異的膀胱癌標志物仍是研究的重點，制備早期診斷試劑盒，實現快速檢測，在膀胱癌的診斷方面具有重要的臨床價值；另一方面，進行尿樣中的細胞檢測，避免炎癥、血尿等非特異癥狀的影響，準確性最高。
技術實現思路
(一)解決的技術問題本專利技術著眼于膀胱癌的早期診斷與膀胱癌病人的跟蹤觀察，擬解決現行的膀胱癌診斷方面的難題，即采用特異的識別膀胱癌細胞兩株單克隆抗體，實現膀胱癌細胞的雙抗體識別與捕獲，結合高靈敏的化學發光免疫分析方法，定量檢測尿脫落膀胱癌細胞，不需要昂貴的檢測儀器，便于臨床推廣，具有良好的市場應用價值，將會彌補市場現有試劑盒的不足。本專利技術的目的是提供一種特異的膀胱癌細胞捕獲、識別方法，以及高靈敏檢測試劑盒。本專利技術的另一目的是提供一種用于膀胱癌早期診斷、術后監測的試劑盒。本專利技術的另一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。(二)技術方案 本專利技術具體提供以下試劑盒[I] 一種用于檢測人膀胱癌細胞的試劑盒，所述試劑盒包括兩種特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體。[2]根據[I]所述的試劑盒，所述試劑盒包括I)膀胱癌EJ細胞標準品；2)由特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體包被的磁顆粒；3)酶標記的特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體；4)3)中的酶所作用的化學發光底物；5)反應管或微孔板，所述反應管或微孔板優選經過無蛋白封閉液的封閉處理，所述無蛋白封閉液為含有1. O %的魚水解明膠，PH7. 2的O. 02M磷酸鹽緩沖液；6)與5)中的反應管或微孔板配套的磁分離器。[3]根據[2]所述的試劑盒，其中所述膀胱癌EJ細胞標準品為膀胱癌EJ細胞的逐級稀釋液。[4]根據[2]所述的試劑盒，其中，2)中所述的特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 6906的雜交瘤細胞株制備的單克隆抗體BCMab2，其與磁顆粒通過共價鍵結合。[5]根據[2]所述的試劑盒，其中，2)中所述的磁顆粒是粒徑為IOOnm至Ιμπι的氧化硅羥基磁顆粒。[6]根據[2]所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶標記的特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體是酶標記的BCMabl單克隆抗體,所述BCMabl單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 3845的雜交瘤細胞株制備(關于BCMabl單克隆抗體的制備具體可以參見中國專利申請號201010251384. 6)。[7]根據[2]所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶。[8]根據[2]所述的試劑盒，其中，5)中所述的反應管是具有光學透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是適用于化學發光反應的檢測的白色微孔板。本專利技術還提供制備所述試劑盒的方法方法，所述方法包括以下步驟I)配制膀胱癌EJ細胞標準品對膀胱癌EJ細胞溶液進行逐級稀釋以制成膀胱癌EJ細胞的逐級稀釋液；2)制備鏈酶親合素修飾的磁顆粒；3)分別使用保藏號為CGMCC No. 3845和CGMCC No. 6906的兩株單克隆雜交瘤細胞株制備可特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體BCMabl和BCMab2 ；4)制備生物素化的單克隆抗體BCMab2 :在微堿性條件下將生物素_N_羥基琥珀酰亞胺與所述抗體的游離賴氨酸發生偶聯反應；5)使用2)中制備的鏈酶親合素修飾的磁顆粒和4)中制備的生物素化的單克隆抗體BCMab2，通過鏈酶親合素與生物素的特異性結合反應，制備由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒； 6)制備酶標記的單克隆抗體BCMabl :采用碳化二亞胺(EDC)偶聯法，實現所述抗體上的氨基與所述酶分子上的羧基的結合；7)配制6)中的酶所作用的化學發光底物液；8)組裝為成品。優選地，所述方法還包括以下步驟a)在所述由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒的制備后，用封閉液封閉所制備的由生物素化的單克隆抗體BCMab2包被的磁顆粒以降低非特異性吸附，所述封閉液包含O. 2% 1.0%牛血清白蛋白、O. 5% 1.0%酪蛋白、O. 5% 1.本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于檢測人膀胱癌細胞的試劑盒，所述試劑盒包括兩種特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體。
【技術特征摘要】
1.一種用于檢測人膀胱癌細胞的試劑盒，所述試劑盒包括兩種特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體。2.根據權利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒包括1)膀胱癌EJ細胞標準品；2)由特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體包被的磁顆粒；3)酶標記的特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體；4)3)中的酶所作用的化學發光底物；5)反應管或微孔板，所述反應管或微孔板優選經過無蛋白封閉液的封閉處理，所述無蛋白封閉液為含有1. O %的魚水解明膠，pH7. 2的O. 02M磷酸鹽緩沖液；6)與5)中的反應管或微孔板配套的磁分離器。3.根據權利要求2所述的試劑盒，其中所述膀胱癌EJ細胞標準品為膀胱癌EJ細胞的逐級稀釋液。4.根據權利要求2所述的試劑盒，其中，2)中所述的特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體是由保藏號為CGMCC No. 6906的雜交瘤細胞株制備的單克隆抗體BCMab2，其與磁顆粒通過共價鍵結合。5.根據權利要求2所述的試劑盒，其中，2)中所述的磁顆粒是粒徑為IOOnm至Ιμπι的氧化硅羥基磁顆粒。6.根據權利要求2所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶標記的特異識別膀胱癌細胞表面抗原的單克隆抗體是酶標記的BCMabl單克隆抗體,所述BCMabl單克隆抗體由保藏號為 CGMCC No. 3845的雜交瘤細胞株制備。7.根據權利要求2所述的試劑盒，其中，3)中所述的酶是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶。8.根據權利要求2所述的試劑盒，其中，5)中所述的反應管是具有光學透明度的聚苯乙烯管、聚乙烯管、聚丙烯管或者玻璃管；所述微孔板是適用于化學發...
【專利技術屬性】
技術研發人員：范祖森，張倩云，李翀，杜穎，王彥英，楊昭，
申請(專利權)人：中國科學院生物物理研究所，
類型：發明
國別省市：
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