本發明專利技術涉及降低由畢赤酵母生產的胰島素或胰島素類似物前體分子的O-糖基化水平的方法。本發明專利技術通過破壞蛋白甘露糖基轉移酶（PMT）基因提供了包括畢赤酵母尤其是巴斯德畢赤酵母的甲醇營養型酵母的基因工程敲除菌株，且使它們能夠生產糖基化減少的異源性蛋白質。本發明專利技術考慮了用于轉化甲醇營養型酵母的載體，這些載體包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、和PMT6基因的編碼序列。本發明專利技術的PMT失活菌株已經保藏在MTCC，Chandigarh。這些菌株是PMT1/GS115（MTCC?5515）、PMT4/GS115（MTCC?5516）、PMT5/GS115（MTCC?5517）以及PMT6/GS115（MTCC5518）。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及破壞巴斯德畢赤酵母的蛋白甘露糖基轉移酶(PMT)基因，從而減少由畢赤酵母生產的胰島素前體分子的O-糖基化水平。本專利技術提供了甲醇營養型酵母的基因工程敲除菌株，包括畢赤酵母尤其是巴斯德畢赤酵母，能夠生產糖基化減少的異源性蛋白質。本專利技術考慮了用于轉化甲醇營養型酵母的載體，這些載體包括PMTl、PMT2、PMT4、PMT5、 和PMT6基因的編碼序列。
技術介紹
已經在多種微生物表達系統中生產了胰島素、胰島素類似物和/或衍生物的重組形式。目前生物體，例如大腸桿菌，釀酒酵母，已經用于商業化生產重組人胰島素及其衍生物。由于這些系統的某些缺點，例如低表達水平，在下游純化中的困難等，甲醇營養型酵母巴斯德畢赤酵母已經有利地用作蛋白質表達系統。該表達系統提供了若干優點例如高表達，處理簡單，生產成本低，高密度培養(US6800606)。因為酵母表達系統易于生長，快速并且可按比例放大，它們是廣泛使用的；然而， 一些酵母表達系統產生了不一致的結果，并且有時難以實現高產率。顯示較大前途的一種酵母表達系統是甲醇營養型酵母，巴斯德畢赤酵母。與其他真核生物表達系統相比較，因為畢赤酵母不存在與動物細胞培養中生產蛋白質的細菌或病毒污染問題相關的內毒素問題， 它有許多優點(Cino, Am Biotech Lab, May 1999)。雖然多個優點歸因于基于酵母的表達系統，例如巴斯德畢赤酵母，這個系統主要的一個缺點是得到蛋白質的翻譯后修飾，其隨后在終產物中以雜質形式存在，該終產物難以純化。雖然存在許多已知的蛋白質翻譯后修飾，翻譯后修飾的最常用形式還是糖基化(Hart G. ff, Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992;4:1017)。根據表達系統糖基化可以是 N-連接的或 O-連接的(Gemmill TR et al. , Overview of N-and 0-linked oligosaccharide structures found in various yeast species, Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426:227)。糖基化影響蛋白質構象的穩定性、免疫原性、清除率、 保護避免蛋白質水解以及改善蛋白質溶解度(Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006;24:769)。在酵母中，在高爾基體中糖支鏈的修飾涉及通過不同的甘露糖酶轉移酶進行甘露糖殘基的一系列添加(“外部鏈”糖基化)。所述外部鏈糖基化的結構是生物體特異性的。這類糖基化通常是不期望的，因為在碳水化合物組成以及分子量兩個方面，均會導致重組蛋白質產物的異質性，這可能使蛋白質純化復雜化。它還可以使蛋白質變成高度免疫原性或可以引起不期望的變應性反應。雖然在改善生物技術制造方面有很大進步，對于每種蛋白質沒有統一的解決方案。用于特異性治療蛋白質的制造方法需要新穎的以及創造性的對問題的解決方案，它們對于該蛋白質或蛋白質家族可以是特異性的。因此，期待以下的基因工程甲醇營養型酵母菌 株，例如巴斯德畢赤酵母，其中可以操縱蛋白質的糖基化，基本上是減少，并且可以從中生產具有哺乳動物樣翻譯后模式的重組糖蛋白質，而不影響期望的終產物的產率。
技術實現思路
因此，本專利技術涉及減少從甲醇營養型酵母生產的蛋白質的糖基化的方法，所述方法通過失活選自包括PMTl、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的組中的至少一個或多個基因能夠實現，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述序列編碼蛋白甘露糖基轉移酶或其功能性部分；一種包含選自下組的蛋白甘露糖基轉移酶基因或其功能性部分的載體，所述組包括 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5 和 PMT6 基因，所述 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5 和 PMT6 基因分別具有與 SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述載體整合到同源基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基轉移酶在宿主中，優選在甲醇營養型酵母中的表達；用于生產甲醇營養型酵母的敲除菌株的方法，其中(a) —種載體并入了能夠同源重組的核酸序列，所述同源重組的核酸序列包含編碼選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6 的組中的基因的至少一個的目標核酸序列和編碼選擇標記的核酸序列，所述PMT1、PMT2、 PMT4、PMT5和PMT6分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，(b)在允許在所述載體中編碼目標基因的DNA與在宿主細胞中編碼目標·基因的DNA之間發生同源重組的條件下培養細胞，從而導致破壞宿主細胞中的目標基因，(c) 用失活的目標基因來選擇宿主細胞；從上述方法生產的蛋白質；一種甲醇營養型酵母敲除菌株，具有選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的組中至少一個失活基因，所述PMTl、 PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80% 同源性的核苷酸序列；如上所述的PMTl基因失活菌株；如上所述的PMT4基因失活菌株；如上所述的PMT5基因失活菌株；如上所述的PMT6基因失活菌株；從如上所述敲除菌株生產的蛋白質；從根據權利要求23所述的敲除菌株生產的蛋白質，其中該敲除菌株是MTCC5515 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5516 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5517 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5518 (保藏日期2010年I月18日)或其任何修飾菌株中的一種；以及根據上面說明中任一項所述的蛋白質，其中所述蛋白質顯示改變的糖基化。本專利技術涉及生產糖基化減少的蛋白質的方法，所述方法涉及對甲醇營養型酵母菌株進行基因修飾并且使它們能夠生產糖基化減少的蛋白質的載體用途。在一個優選實施方式中，本專利技術的失活載體包括編碼蛋白甘露糖基轉移酶(PMT， 長萜基磷酸甘露糖蛋白甘露糖基轉移酶蛋白質，E. C. 2. 4.1. 109)的核苷酸序列或其功能性部分，并且能夠破壞或失活甲醇營養型酵母菌株中的蛋白甘露糖基轉移酶或功能性部分。 優選的核苷酸序列是在SEQ ID USEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5中表示的編碼 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因的核苷酸序列以及它的功能性部分，其被選擇用于破壞在 SEQ ID 6、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 10 中分別表示的基因。根據在本專利技術中提出的方法，可以將能夠表達異源性蛋白質的核苷酸序列引入到甲醇營養型酵母菌株中，該菌株在前面已經以逐步方式用本專利技術的一種或多種載體進行轉化。這種酵母菌株可以連續地或同時地用本專利技術的一種或多種載體進行轉化。另外，可以用一種或多種本專利技術的失活載體來轉化甲醇營養型酵母菌株，這些載體包括如在序列表中表示的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.02.10 IN 332/CHE/20101.一種減少由甲醇營養型酵母生產的蛋白質的糖基化的方法，所述方法通過失活選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的組中的至少一個或多個基因能夠實現，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述序列編碼蛋白甘露糖基轉移酶或其功能性部分。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母屬于畢赤酵母。3.根據權利要求2所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。4.根據權利要求1所述的方法，其中所述蛋白質是通過式I表示的 X-B-Y-A 其中， X是包括至少一個氨基酸的前導肽序列， B是胰島素分子B鏈的氨基酸序列、它的衍生物或類似物， Y是包括至少一個氨基酸的連接肽， A是胰島素分子A鏈的氨基酸序列，它的衍生物或類似物， 并且所述A和B鏈可以通過氨基酸取代、缺失和/或添加來修飾。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述糖基化的方式是O-糖基化。6.根據權利要求1所述的方法，其中糖基化減少至少10%至約99%。7.根據權利要求6所述的方法，其中糖基化減少25%。8.根據權利要求6所述的方法，其中糖基化減少65%。9.一種包含蛋白甘露糖基轉移酶基因或其功能性部分的載體，所述蛋白甘露糖基轉移酶基因或其功能性部分選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的組，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述載體整合到同源基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基轉移酶在宿主中，優選在甲醇營養型酵母中的表達。10.一種減少或改變甲醇營養型酵母生產的蛋白質上的糖基化的方法，包括用權利要求9所述的載體轉化所述酵母。11.根據權利要求9所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母屬于畢赤酵母。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。13.一種用于生產甲醇營養型酵母的敲除菌株的方法，其中(a)—種載體并入了能夠同源重組的核酸序列，所述同源重組的核酸序列包含編碼選自包括PMT...
【專利技術屬性】
技術研發人員：納加拉杰·戈文達帕，科瑪爾·卡諾賈，克里希納穆爾蒂·文卡特森，尼特斯·戴夫，穆克什·巴布阿帕·帕塔勒，桑賈伊·蒂瓦里，克達納斯·N·薩斯特里，哈里什·耶爾，
申請(專利權)人：拜康有限公司，
類型：
國別省市：
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