本發明專利技術涉及一種用固定化酶生產糖基化葛根素的方法，步驟如下：1）粗酶的制備：將菌體經高壓破碎，離心得粗酶液；2）固定化酶的制備：將粗酶與預處理的纖維素于磷酸緩沖液中反應，使酶固定在纖維素表面，酶的量為2-15mg酶/g濕重纖維素；3）糖基化葛根素的制備：在攪拌條件下，將溶于反應介質中的葛根素與固定化酶進行轉化反應，反應體系的ph為3.0-8.0，溫度5-50℃，時間1-24小時；4）糖基化葛根素的純化：將轉化液經雙柱串聯層析分離，旋轉蒸發儀濃縮，冷凍干燥，制得糖基化葛根素；反應結束后，過濾回收固定化酶。本發明專利技術的優點為：成本低，轉化副產物少，固定化酶可重復利用，適應于規模化生產。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及糖基化葛根素的制備，具體地說是。
技術介紹
葛根素(puerarin),8-C- β -D-葡萄糖基-7，4' 二輕基-異黃酮(8-C- β -D-Glucopyranosyl-7, 4' -hydroxy-1soflavone)。葛根素毒性小、安全范圍廣、療效好，具有廣泛的 藥理作用，臨床上主要應用于心腦血管系統疾病、糖尿病、眼底疾病、突發性耳聾、急性酒精中毒、擬菊酯類農藥中毒及腫瘤的治療。但是臨床使用中葛根素存在如下缺點(1)體內消除速率快，臨床使用劑量較大，口服生物利用度低；(2)葛根素水溶解度低，僅為6. 24g/L，因此臨床使用的注射劑中需加入助溶劑，以提高溶解度。因此對葛根素進行修飾改造，改善其水溶性和脂溶性，提高其生物利用度及選擇性，最終增強其藥理活性，是一種行之有效的開發新藥途徑，也是當前葛根素研究的熱點。研究表明，氧化微桿菌(Microbacterium oxydans CGMCC 1788)通過靜息細胞轉化或細胞粗酶提取液轉化，可以將葛根素轉化為葛根素-7-0-葡萄糖苷。與葛根素相比，葛根素-7-0-葡萄糖苷水溶解度提高18倍，有較長的半衰期及平均滯留時間，能在血液中維持較高的血藥濃度，舒張血管作用也略優于天然葛根素。同時，采用TritonX-100處理氧化微桿菌，破壞其細胞膜結構，增加細胞滲透性，可以將葛根素轉化為葛根素-7-0-果糖苷。但是由于細胞膜的屏障作用，靜息細胞轉化積累產物耗費的時間較長，副產物較多；細胞反復回收利用，細胞逐漸自溶，轉化活性降低，不利于規模化生產；細胞粗酶提取液在反應過程中極易受pH、溫度等外界環境影響而變性失活；粗酶提取液不能回收再利用，也不易長期保存；酶純化過程異常復雜繁瑣，耗時長、得率低；因此細胞轉化和細胞粗酶提取液轉化效率低，周期長，不利于工業化生產。固定化酶將為工業化生產糖基化葛根素提供新技術。固定化酶是指固定在適合載體上并在一定空間范圍內能連續進行催化反應的酶。固定化酶不僅保持了酶的催化特性，而且克服了游離酶的不足，具有增加酶的穩定性，酶可反復或連續使用以及酶和反應產物易于分離的優點，因而效率高、成本低。自從20世紀60年代日本首次固定化氨基酰化酶工業化連續生產L-氨基酸以來，固定化酶技術為酶的工業化運用開辟了廣闊的發展空間。但至今，固定化酶在生產糖基化葛根素方面的應用尚未見相關專利和報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種酶可以回收并重復利用的用固定化酶轉化葛根素生產糖基化葛根素的方法。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為用固定化酶生產糖基化葛根素包括如下操作步驟(I)粗酶液的制備將氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans CGMCC 1788)培養至 OD6tltlL O—3. O,離心收集菌體，加預冷PH8. O的磷酸緩沖液重懸，破碎兩次，離心得粗酶液。測定粗酶液蛋白濃度。所述菌種培養過程為將菌種劃線于LB平板，30°C培養至出現單菌落，用牙簽挑取單菌落于種子培養基(20mL LB/100mL錐形瓶)，30°C、220rpm振蕩培養24h，以1%的接種量接入擴大培養基(IL LB/3L錐形瓶)，30°C、220rpm培養12h ；所述菌液離心條件為8000rpm，4°C，離心lOmin。菌體破碎后離心條件為 8000-12000rpm，O-1OO，離心 10_30min ；所述蛋白濃度測定方法為bradford法(1970)。(2)固定化酶的制備稱取一定量纖維素，預處理后與粗酶液于磷酸緩沖液中進行反應，使酶固定在纖維素表面，制備得到固定化酶，測定其活力。所述纖維素為DEAE—纖維素、CM—纖維素或DEAE—纖維素與戊二醛交聯載體。預處理方法分別為=DEAE-纖維素預處理，加入適量去離子水浸泡攪拌過夜后，經布氏漏斗抽濾掉去離子水。加入適量0. 5mol/L HCl處理Ih后，抽濾掉多余HC1，去 離子水反復清洗至中性。隨后加入適量0. 5mol/LNa0H處理Ih后，抽濾掉多余NaOH，去離子水反復清洗至中性； CM-纖維素預處理，加入適量去離子水浸泡攪拌過夜后，經布氏漏斗抽濾掉去離子水。加入適量0. 5mol/L NaOH處理Ih后，抽濾掉多余NaOH，去離子水反復清洗至中性。隨后加入適量 0. 5mol/L HCl處理Ih后，抽濾掉多余HC1，去離子水反復清洗至中性；稱取0. 5g DEAE-纖維素，加入25ml戊二醛(濃度分別為1%、3%、6%)，于30°C、220rpm下交聯6h。離心去除上清， 并用去離子水反復清洗至無戊二醛殘留，去除多余去離子水，制得交聯載體；所述反應條件為ρΗ3·0-8·0，反應溫度0-25°C，反應時間2_12h，酶的量為2_15mg 酶/g濕重纖維素；所述酶活力測定方法如下游離酶活力測定5ml游離酶中加入5ml濃度為8mg/ml葛根素轉化液(ρΗ8· 0)，于 30°C、220rpm下反應12h，HPLC分析測定酶活。固定化酶活力測定固定化酶中加入IOml濃度為4mg/ml葛根素轉化液(pH8. 0), 于30°C、220rpm下反應12h，HPLC分析測定酶活。+ 粗_活力-上清中酶活力-洗液中酶活力 W 疋化率=-1! *-X100,丁固定化_總活力ιηΛ活力_收牟=加入酶總活力1X100固定化酶相對活力是指在同組試驗中以活性最高的為100，其余固定化酶之比值，以百分數表示。酶活力定義每小時催化產生Iumol糖基化葛根素所需酶量定義為一個酶活力單位(IU)。(3)糖基化葛根素的制備在攪拌條件下，將葛根素溶于緩沖液中，與步驟(2)制備的固定化酶進行轉化反應，處理轉化液。所述轉化反應體系的條件為pH3. 0-8. 0，溫度5_50°C，時間1_24小時；所述轉化液處理方法為轉化液于8000rpm下離心lOmin，取上清，100°C恒溫加熱IOmin后，于12000rpm下離心IOmin,取上清。(4)糖基化葛根素的純化 采用普通濕法裝柱，將預處理好大孔樹脂填充至層析柱。將步驟(3)制備的轉化液經層析系統分離，洗脫液經HPLC檢測，將糖基化葛根素檢測純度大于95%的洗脫液經旋轉蒸發儀濃縮，再經冷凍干燥獲得高純度的糖基化葛根素。所述大孔樹脂預處理過程為層析柱內加入相當于裝填樹脂體積O. Γ0. 5倍的乙醇或甲醇，然后將新樹脂投入層析柱中。使其液面高于樹脂層約O. 3m處，并浸泡24h。用兩倍體積的乙醇或甲醇，以2倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡4 5h。用乙醇或甲醇，以2倍體積/小時的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色混濁止。并以水以同樣流速洗凈乙醇或甲醇。用2倍體積的5%HC1溶液，以4 6倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡2 4小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。用2倍體積的2%NaOH溶液，以4飛倍體積/小時的流速通過樹脂層，并浸泡2 4小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性；所述HPLC檢測條件采用Agilent 1100高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentHC-C18柱(250X4. 6 μ m，5 μ m)，柱溫為室溫；進樣體積為20 μ L ;檢測器為AgilentG1314A紫外檢測器，波長為254nm，；流動相A :經O. 22本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用固定化酶生產糖基化葛根素的方法，其特征在于包括如下步驟：（1）粗酶液的制備將氧化微桿菌（Microbacterium?oxydans?）CGMCC?1788培養至OD600?1.0—3.0，離心收集菌體，加預冷pH8.0的磷酸緩沖液重懸，破碎兩次，離心得粗酶液；?（2）固定化酶的制備稱取一定量纖維素，預處理后與粗酶液于磷酸緩沖液中進行反應，使酶固定在纖維素表面，制備得到固定化酶;（3）糖基化葛根素的制備在攪拌條件下，將葛根素溶于緩沖液中，與步驟（2）制備的固定化酶進行轉化反應，反應體系的pH為3.0?8.0，溫度5?50℃，時間1?24小時，即制得含糖基化葛根素的轉化液；（4）糖基化葛根素的純化采用濕法裝柱，將預處理好大孔樹脂填充至層析柱，將步驟（3）制備的轉化液經層析系統分離，洗脫液經HPLC分析測定，將糖基化葛根素純度大于95%的洗脫液濃縮，再經冷凍干燥獲得高純度的糖基化葛根素。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉貴友，袁生，孫磊，封建樹，黃國棟，崔沂，陸舟，沈嬌嬌，武秀秀，
申請(專利權)人：南京師范大學，江蘇教育學院，
類型：發明
國別省市：
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