使用具有編碼肽酶的基因的減弱表達(dá)的腸桿菌科的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了使用經(jīng)修飾減弱選自pepA、pepB和pepD基因的一種或多種基因的表達(dá)的腸桿菌科的細(xì)菌，特別是屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-賴氨酸的方法。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及微生物工業(yè)，并具體涉及產(chǎn)生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-賴氨酸的方法。本方法使用經(jīng)修飾減弱編碼肽酶的基因的表達(dá)的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌。
技術(shù)介紹
常規(guī)地，L-氨基酸在工業(yè)上通過利用來自自然來源的微生物菌株或其突變體的發(fā)酵方法產(chǎn)生。通常，所述微生物經(jīng)修飾而增強L-氨基酸的生產(chǎn)收率。已報道了許多增強L-氨基酸生產(chǎn)收率的技術(shù)，包括通過用重組DNA(參見，例如美國專利號4，278，765)轉(zhuǎn)化微生物。其他增強生產(chǎn)收率的技術(shù)包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性，和/或使由產(chǎn)生的L-氨基酸造成的反饋抑制的靶酶脫敏(參見，例如，W095/16042 或美國專利號 4，346，170 ;5，661，012 和 6，040，160)。其它增強L-氨基酸生產(chǎn)收率的方式是減弱一種或幾種涉及靶L-氨基酸的降解的基因，使靶L-氨基酸的前體從L-氨基酸的生物合成途徑轉(zhuǎn)向的基因，涉及碳、氮和磷通量的重新分配的基因，以及編碼毒素的基因等的表達(dá)。來自大腸桿菌(Escherichia coli)的pepA基因(同義詞carP)編碼組合了催化和調(diào)節(jié)特性的多功能酶氨肽酶A(PepA)。已顯示除了水解蛋白質(zhì)的N端氨基酸殘基之外，還需要氨肽酶A進(jìn)行位點特異性DNA重組和質(zhì)粒多聚體的單體化(monomerization)(Stirling 等(1989)EMB0 J.，8，1623-1627;Charlier 等(1995)J.Mol.Biol.，250，392-406)。另一種氨肽酶A功能是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。P印A是DNA結(jié)合蛋白，并涉及調(diào)控氨甲酰磷酸合酶的合成的carAB操縱子的轉(zhuǎn)錄抑制(Roovers等，(1988) J. Mol.Biol.，204，857-865)。氨甲酰磷酸是L-精氨酸和嘧啶生物合成途徑的中間體。氨甲酰磷酸和L-鳥氨酸之間的相互作用導(dǎo)致L-瓜氨酸形成，其通過L-精氨琥珀酸轉(zhuǎn)化為L-精氨酸。來自大腸桿菌的P印B基因(同義詞yhfI，b2523，ECK2520)編碼氨肽酶B (PepB)，其為大腸桿菌中的四種半胱氨酰甘氨酸酶(cysteinylglycinase)之一。氨肽酶B在體外切割 Leu-Gly, Leu-Gly-Gly, Cys-Gly 和 Leu-Gly (Miller 等(1994) Journal of Bacteriology, 176, 610-619, Hermsdorf 等(1979)International Journal of Peptideand Protein Research, 13，146-151，Suzuki 等(2001)Bioscience.Biotechnology.Biochemistry.，5，1549-1558)。在體內(nèi)，氨肽酶B與氨肽酶A和N，以及二肽酶D —起，為四種半胱氨酸甘氨酸酶之一(Suzuki 等，(2001) Journal of Bacteriology2001; 183 (4) 1489-1490)。二價陽離子，包括一些并非活性的有效刺激劑的，穩(wěn)定化氨肽酶免受熱失活(Suzuki等(2001)Bioscience. Biotechnology. Biochemistry. , 5, 1549-1558.)。來自大腸桿菌的P印D基因(同義詞P印H ，肌肽酶)編碼肽酶D，其為能夠分解多種具有未封閉的(unblocked)N端的二肽,包括半胱氨酰甘氨酸的二肽酶(Schroeder等，(1994)FEMS Microbiology Letters,123, 153-159, Suzuki 等，(2001)Journal ofBacteriology, 183, 1489-1490)。月太酶 D 作為 PepD 單體的二聚體起作用(Klein 等，(1986)Journal of General Microbiology, 132，2337-2343)。在磷酸鹽饑餓過程中，pepD 的轉(zhuǎn)錄增加至五倍(Henrich 等，(1992)Molecular General Genetics, 232，117-125)。然而，目前并無減弱編碼肽酶的基因的表達(dá)·用于產(chǎn)生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-賴氨酸的報道。本專利技術(shù)的公開本專利技術(shù)的諸方面包括增強能夠產(chǎn)生L-氨基酸，如L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-賴氨酸的菌株的生產(chǎn)率，并提供使用這些菌株產(chǎn)生此種L-氨基酸的方法。 上述諸方面通過發(fā)現(xiàn)使編碼肽酶P印A，pepB,和/或pepD的基因失活可增強L-氨基酸，如L-精氨酸和L-賴氨酸的產(chǎn)生而實現(xiàn)。此外，因為L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途徑中的中間物，所以亦可增強此L-氨基酸的產(chǎn)生。本專利技術(shù)提供了具有增加的產(chǎn)生L-氨基酸如L-精氨酸和L-瓜氨酸的能力的腸桿菌科的細(xì)菌。本專利技術(shù)的一個方面是提供具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的腸桿菌科的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而減弱了選自下組的一種或多種基因的表達(dá)pepA, pepB,和pepD基因。本專利技術(shù)的另一個方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述基因的表達(dá)通過使所述基因失活來減弱。本專利技術(shù)的另一個方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。本專利技術(shù)的另一個方面是提供根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(Escherichia coli)。本專利技術(shù)的另一個方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于泛菌屬(Pantoea)。本專利技術(shù)的另一個方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述L-氨基酸選自下組L_精氨酸，L-瓜氨酸和L-賴氨酸。本專利技術(shù)的另一個方面是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾減弱pepA，pepB和P印D基因的表達(dá)，且所述L-氨基酸是L-賴氨酸。本專利技術(shù)的另一個方面是提供產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌；和從培養(yǎng)基收集所述L-氨基酸。本專利技術(shù)的另一個方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸選自下組L_精氨酸，L-瓜氨酸和L-賴氨酸。附圖說明圖1顯示了引物對Pl和P2在質(zhì)粒pMW118-attL-Cm_attR上的相對位置。圖2顯示包含失活的P印A基因的染色體DNA片段的構(gòu)建。實施方式的說明本專利技術(shù)如下詳述。1.細(xì)菌根據(jù)本專利技術(shù)公開的主題的細(xì)菌是具有產(chǎn)生L-氨基酸如L-精氨酸，L-瓜氨酸或L-賴氨酸的能力的腸桿菌科的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而減弱了選自下組的一種或多種基因的表達(dá)編碼氨肽酶的P印A，P印B和P印D基因。術(shù)語“具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌”可意指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌時，能夠產(chǎn)生L-氨基酸并將其分泌入培養(yǎng)基的細(xì)菌。術(shù)語“具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌”亦可意指能夠產(chǎn)生L-氨基酸如L-精氨酸，L-瓜氨酸或L-賴氨酸，并導(dǎo)致所述L-氨基酸在培養(yǎng)基中以大于大腸桿菌的野生型或親本株(如大腸桿菌K-12)的量蓄積的細(xì)菌，并且可意指所述微生物能夠在培養(yǎng)基中造成不少于O. 5g/L,在另一個實施例中不小于1. Og/L的L-氨基酸的量的蓄積。術(shù)語“L-氨基酸”可包括L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-賴氨酸。 腸桿菌科包括屬于埃希氏菌(Escherichia)屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.06.03 RU 20101226471.一種具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的腸桿菌科細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而減弱了選自下組的一種或多種基因的表達(dá)pepA, pepB,和pepD基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述基因的表達(dá)通過使所述基因失活來減弱。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的細(xì)菌,其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。4.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)菌,其中所述細(xì)菌是大腸桿菌(Escherichiacoli)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：DV菲利波夫，TV利奧諾瓦，EB沃羅希洛瓦，MM古斯亞蒂納，守屋美加，長井由利，野口景子，
申請(專利權(quán))人：味之素株式會社，
類型：
國別省市：