本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15-1共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，以抗病品種皖豆15作為父本，感病品種Williams（rps）作為母本，雜交產(chǎn)生F1代，通過自交產(chǎn)生F2:3群體作為作圖群體，用已公布的大豆SSR標(biāo)記和根據(jù)大豆基因組序列開發(fā)新的SSR標(biāo)記，對皖豆15含有的抗病基因進(jìn)行遺傳作圖和精細(xì)定位?？共』騌psWD15-1被定位在第17號染色體上，位于標(biāo)記Sattwd15-24/25(0.5cM)和Sattwd15-47(0.8cM)之間。同時，還獲得與基因RpsWD15-1共分離的分子標(biāo)記Sattwd15-28。該標(biāo)記可用于大豆抗疫霉根腐病的輔助選擇育種中。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWDI5-1共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程和農(nóng)作物抗病遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RPSWD15-1共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaμ fmann & Gerdemann)引起的大豆疫霉根腐病是危害大豆生產(chǎn)的主要病害之一。近年來，該病害在大豆主產(chǎn)區(qū)黑龍江省危害日益突出，危害大豆面積達(dá)15 X IO4公頃。該病害可在大豆的任何生育階段造成危害，一般田塊減產(chǎn)10-30%，嚴(yán)重地塊可達(dá)60-90%，甚至造成絕產(chǎn)，對大豆生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。目前，大豆疫霉根腐病已經(jīng)成為威脅我國大豆生產(chǎn)的常見病害，所以對該病害的防治刻不容緩。實踐證明，培育和種植抗病品種是最為安全、經(jīng)濟(jì)和有效的措施。為此，許多學(xué)者在篩選抗性資源及抗病基因定位方面做了大量的研究。研究表明，大豆對疫霉根腐病的抗性分為質(zhì)量性狀抗性(小種抗性)和數(shù)量性狀抗性。質(zhì)量性狀抗性由顯性基因控制，具有完全抗性。迄今，國外已在大豆基因組9個位點上鑒定了 15個抗大豆疫霉根腐病基因(Rps)， 即 Rpsla, Rpslb, Rpslc, Rpsld, Rpslk, Rps2, Rps3a, Rps3b, Rps3c, Rps4, Rps5, Rps6, Rps7, Rps8和 theRps gene in cv. Waseshiroge,分別位于大 基因組第 3，16, 13, 18, 18, 18, 3, 13 和3號染色體上(MLG(Sugimoto等，2012)。大豆疫霉根腐病在我國發(fā)生的歷史較短，抗病育種工作也剛剛起步。目前，我國只鑒定了 4個抗病基因 RpsYB30, RpsYD25, RpsZS18，RpsSNlO分別位于大豆基因組第19，3，2和13號染色體上(MLG L, N, Dlb和F)(范愛穎等，2009，孫石等，2011，姚海燕等，2010，于安亮等，2010，朱振東等， 2007)。我國大豆疫霉具有群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，適應(yīng)范圍廣和毒力變化快等特點，容易產(chǎn)生新的毒力型小種和克服品種抗性。一般認(rèn)為大豆疫霉根腐病基因的使用壽命為10-15年，但是新的抗病基因被克服的速度正在加快，如RpsS被鑒定后不到3年，就已發(fā)現(xiàn)了能夠克服其抗性的新的毒力型的大豆疫霉菌株。大量研究表明國外已鑒定的15個抗病基因中(除 the Rps gene in cv. Waseshiroge外)，除Rpslc和Rpslk外，都不能有效抵抗我國病區(qū)的大豆疫霉種群。因此，有必要大力挖掘和利用新的抗性資源并不斷地進(jìn)行抗病基因的累加， 培育抗性持久的大豆品種。為挖掘新的大豆抗性資源，大多數(shù)學(xué)者借助SSR分子標(biāo)記(http://soybase.org) 進(jìn)行抗病基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇育種。該類標(biāo)記具有高信息量、可靠性強(qiáng)、簡便和快速等優(yōu)點，得到廣泛的應(yīng)用。此外利用已公布的大豆基因組序列(http://www. Phytozome. net)開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，可以對基因進(jìn)行精細(xì)定位，獲得基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。大豆品種皖豆15是安徽省潘村湖農(nóng)場農(nóng)科所用蒙慶13經(jīng)輻射后系統(tǒng)選育而成的，于1996年通過安徽省品質(zhì)審定。該品種對大豆病毒病和霜霉病具有高抗性(李俊山 2007)。前期研究結(jié)果表明，該品種對不同毒力型的兩個大豆疫霉菌株P(guān)sMCl和PsMC2均有較強(qiáng)的抗性(朱振東等，2001)。陳曉玲等(2008)和夏長劍等(2011)再次報道皖豆15對大豆疫霉菌株具有廣譜抗性，推測其可能含有新的抗病基因。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的一種與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記，其中，所述候選基因RpsWD15-l位于大豆第17號染色體上，且位于標(biāo)記 Sattwdl5-24/25和Sattwdl5_47之間，與這兩個標(biāo)記的遺傳距離分別為O. 5cM和O. 8cM。所述分子標(biāo)記為Sattwdl5_28，含重復(fù)基序(AT) 23，且用于擴(kuò)增分子標(biāo)記 Sattwdl5-28的PCR引物對為上游引物F:5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和下游引物R:5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。分子標(biāo)記Sattwdl5_28與候選基因RpsWD15_l的遺傳距離為OcM。PCR擴(kuò)增使用的退火溫度優(yōu)選為48°C，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為123bp。 其中，候選基因RpsWD15_l的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本專利技術(shù)還提供用于檢測與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記Sattwdl5-28的PCR引物對，包括上游引物F:5' -GCTTCCTATCACTCTTTGCTG-3'和下游引物R:5' -TTAGGCTAATGATGCTG-3'。本專利技術(shù)還提供與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記在鑒定抗疫霉根腐病大豆品種中的應(yīng)用，其包括步驟1)提取待測大豆的基因組DNA ;2)以待測大豆的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求4所述引物F和R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，如果能夠擴(kuò)增出123bp的產(chǎn)物，則判定為抗疫霉根腐病大豆品種。其中,PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以20 μ I計為大豆基因組DNA模板濃度2ng/y L, 10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，四種dNTP濃度各為20 μ mol/L，上、下游引物濃度各為O. 2ymol/ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5U,用 ddH20 補(bǔ)足至 20 μ I。PCR反應(yīng)使用的條件為95°C 3分鐘；94°C 50秒，48°C 50秒，72°C 50秒，35個循環(huán)；72°C 10分鐘。本專利技術(shù)還提供含有上述引物對的用于檢測抗疫霉根腐病大豆的試劑盒。優(yōu)選所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的一種或多種。本專利技術(shù)還提供上述與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記在植物分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供上述與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分離的分子標(biāo)記在大S·抗疫霉根腐病分子育種中的應(yīng)用。具體地，本專利技術(shù)的與大S·抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15_l共分尚的分子標(biāo)記及候選基因RpsWD 15-1是通過以下方法獲得的利用WilliamsX皖豆15雜交組合衍生的F2:3群體作為作圖群體，研究皖豆15對大豆疫霉根腐病抗性的遺傳基礎(chǔ)；利用已公布的大豆SSR標(biāo)記，篩選與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記；利用大豆基因組序列信息，開發(fā)新的SSR標(biāo)記，對該基因進(jìn)行精細(xì)定位，同時獲得與該基因共分離的分子標(biāo)記。從而為抗大豆抗疫霉根腐病育種提供輔助選擇，提高育種效率，加速抗疫霉根腐病育種工作進(jìn)程。具體技術(shù)方案( I)皖豆15的抗性遺傳分析以抗病品種皖豆15作為父本，感病品種Williams (rps)作為母本，雜交產(chǎn)生F1 代，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F2代，F(xiàn)2代自交產(chǎn)生的102個F2:3家系抗性遺傳分析、抗病基因鑒定及作圖群體。采用下胚軸創(chuàng)傷接種方本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
與大豆抗疫霉根腐病候選基因RpsWD15?1共分離的分子標(biāo)記，其特征在于，所述候選基因RpsWD15?1位于大豆第17號染色體上，且位于標(biāo)記Sattwd15?24/25和Sattwd15?47之間，與這兩個標(biāo)記的遺傳距離分別為0.5cM和0.8cM；所述分子標(biāo)記為Sattwd15?28，含重復(fù)基序(AT)23，且用于擴(kuò)增分子標(biāo)記Sattwd15?28的特異性PCR引物對為：上游引物F：5′?GCTTCCTATCACTCTTTGCTG?3′和下游引物R：5′?TTAGGCTAATGATGCTG?3′。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱振東，張吉清，王曉鳴，夏長劍，段燦星，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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