一種大白菜eIF(iso)4E.c位點轉(zhuǎn)座子插入突變體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種與大白菜eIF(iso)4E.c野生型和轉(zhuǎn)座子插入突變體鑒定直接相關(guān)的位點特異性顯性ASM標(biāo)記：與野生型位點檢測相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4E.c-W，片段大小1216bp，如SEQ?ID?No.1所示；對應(yīng)的突變位點檢測相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM-4e.c-I，片段大小4419bp，SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明專利技術(shù)利用同源克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了eIF(iso)4E.c位點的一個轉(zhuǎn)座子插入突變體并開發(fā)了鑒定該位點的分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記可以對回交轉(zhuǎn)育后代的基因型進行準(zhǔn)確選擇，以尋創(chuàng)造遺傳背景更加豐富的突變體材料。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種基因的突變體及其相關(guān)位點特異性分子標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用，尤其涉及一種大白菜真核生物翻譯起始因子eIF(iso)4E. c的轉(zhuǎn)座子插入突變體及該位點特異性分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用。本專利技術(shù)的突變體能夠為選育含該突變位點的抗病毒大白菜種質(zhì)提供變異源，位點特異分子標(biāo)記能夠直接應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種來選擇含有該突變位點的大白菜材料，提高eIF4E突變體的選擇效率，屬于生物

技術(shù)介紹
大白菜(Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物,原產(chǎn)于中國，目前在世界各地均有種植。尤其在我國蔬菜的常年供應(yīng)和淡季蔬菜調(diào)劑中已經(jīng)成為蔬菜產(chǎn)品供給的重要組成部分，因而對人們生活具有重要影響。在大白菜生產(chǎn)過程中，常遭病毒病、霜霉病和軟腐病等病害的威脅。就整體而言病毒病的危害最為嚴(yán)重，且沒有普遍適用的抗病毒病藥劑或其它行之有效的控制技術(shù)。培育抗病毒大白菜新品種是應(yīng)對病毒病危害的首選途徑。苗立強等研究發(fā)現(xiàn)，我國大白菜病毒病的病原分離物中70%是蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus，TuMV)、還有少量黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)和其它病毒。因此我國大白菜抗病毒病育種的主攻目標(biāo)是抗TuMV。培育抗TuMV大白菜新品種的兩個關(guān)鍵要素是擁有豐富的抗TuMV種質(zhì)資源和高效的育種效率。我國是大白菜原產(chǎn)地，種質(zhì)資源非常豐富，其中不乏抗TuMV的優(yōu)良資源，同時也有更多品質(zhì)優(yōu)良但不抗病毒的資源。在常規(guī)育種實踐中，常通過回交轉(zhuǎn)育的手段獲得更多遺傳背景豐富的抗性材料。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的興起及研究的深入，標(biāo)記輔助選擇在常規(guī)育種操作中已經(jīng)成為提高選擇效率、縮短育種年限的主要手段。一些跨國的育種集團更是不惜重金把創(chuàng)新資源和開發(fā)與重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記作為育種攻關(guān)的主要內(nèi)容。一般而言，要尋找與某農(nóng)藝性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，往往需要先選擇在目標(biāo)性狀方面存在顯著差異的親本，并構(gòu)建分離群體$2，1 1，8(1，0!1等)，采用混合分群(BSA) 和傳統(tǒng)的分子標(biāo)記(如RAPD, SRAP, AFLP, SSR等)技術(shù)進行分析,用相應(yīng)的軟件分析所得標(biāo)記與性狀的連鎖距離，最終得到與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記。目前報道的與大白菜抗蕪菁花葉病毒(TuMV)位點連鎖的分子標(biāo)記正是采用上述方法得到的。由于不同研究者所用材料和所選擇的標(biāo)記類型不同，所得到的與抗病毒特性連鎖的標(biāo)記距離亦不同，介于 3. 8-15. 36cM。由于這些標(biāo)記與性狀的連鎖程度不夠緊密，因而其用于大白菜抗TuMV輔助育種尚有一定的距離。另一方面，由于擬南芥與大白菜同屬十字花科，其抗病毒相關(guān)功能基因已有較深入的研究；同時大白菜的全基因組序列已經(jīng)公布。所以可以將擬南芥功能基因研究的結(jié)果和大白菜基因組序列信息結(jié)合，直接從抗病毒相關(guān)功能基因的角度入手，通過對大白菜自然群體在某一個重要功能基因位點的自然變異入手，尋找抗病毒相關(guān)功能基因的突變體；針對突變位點開發(fā)位點特異性分子標(biāo)記(Allelespecific marker, ASM)，則這種標(biāo)記本身與性狀直接相關(guān)，這無疑會使標(biāo)記輔助選擇更加精準(zhǔn)。在抗病毒功能基因研究方面近年來發(fā)現(xiàn)，由隱性單基因控制的抗病毒性狀多與真核生物翻譯起始因子4E及其異構(gòu)體的突變有關(guān)。Wittmann等和 L6onard 等分別證明擬南芥 eIF4E 和 eIF (iso) 4E 可以同TuMV的病毒基因組結(jié)合蛋白(VPg)相互作用。這種相互作用的關(guān)鍵氨基酸與真核生物自身mRNA翻譯所需的關(guān)鍵氨基酸位點不同，所以eIF4E及eIF(iso)4E的一些氨基酸突變不影響植物自身的生長發(fā)育、卻導(dǎo)致病毒與寄主不能發(fā)生互作，從而使寄主表現(xiàn)出抵抗病毒侵染的特性。Ryder 在生菜、Ruffel 在辣椒、Nieto 在舌甘瓜等重要蔬菜作用中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少這樣的突變體資源，Yeam 等在辣椒中針對突變位點開發(fā)了相應(yīng)的位點特異性CAPs標(biāo)記并用于抗病毒材料轉(zhuǎn)育時的輔助選擇。從其他作物的eIF4E和eIF (iso) 4E突變及其在抗病毒中的作用推測，大白菜自然群體中也可能存在eIF4E和eIF(is0)4E的突變體，且這種突變可能與大白菜的抗病毒特性有關(guān)。我國大白菜種質(zhì)資源十分豐富，但目前，國內(nèi)外有關(guān)大白菜抗病毒特性與eIF4E和eIF(iso)4E關(guān)系的研究很少，涉及的材料極為有限。Rusholme等以高抗TuMV的大白菜自交系RLR22和病毒敏感材料R-0-18為親本，構(gòu)建BClFl群體，進行抗TuMV (⑶N I和CZEl株系)遺傳研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個大白菜抗病毒隱性遺傳位點retrOl和一個顯性位點ConTROl, RFLP標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析分別發(fā)現(xiàn)了與retrO I連鎖的標(biāo)記pN202e I和與ConTRO I連鎖的標(biāo)記p085e I。進一步采用southern 雜交的手段發(fā)現(xiàn)，在A基因組中分別有3個拷貝的eIF4E (分別位于染色體N1、N3和NS)和 3個拷貝的eIF(is0)4E (分別位于染色體N4、N5和NS)。作者根據(jù)雜交結(jié)果，推測位于第8 染色體上的eIF4E和eIF (iso) 4E可能與ConTROl有關(guān)，而位于第4染色體上的eIF (iso) 4E 可能與retrOl有關(guān)。文中沒有關(guān)于兩個基因的序列信息報道。Jenner等從病毒敏感材料 R-0-18 中克隆得到了 eIF4E 和 eIF(iso)4E 各三個拷貝，分別命名為 BraA. eIF(iso)4E. C、BraA. eIF4E. b、 BraA. eIF4E. c 和 BraA. eIF(iso)4Ε· a>BraA. eIF(iso)4E. b、BraA. eIF(iso)4E. c。除 BraA. eIF4E. b和BraA. eIF (iso) 4E. b以外，其余4個基因分別轉(zhuǎn)化擬南芥At. eIF (iso) 4E功能缺失突變體, 然后對所有轉(zhuǎn)基因株系接種TuMV加拿大株系CDNl，進行病毒敏感性互補實驗。根據(jù)病情指數(shù)及ELISA結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所轉(zhuǎn)的四個基因均能使突變體完全或部分恢復(fù)對TuMV侵染的敏感性。這表明，在TuMV侵染白菜類蔬菜作物時，eIF4E和eIF (iso) 4E都可能參與病毒與寄主的相互作用。同時作者指出，要想在大白菜中獲得與eIF4E和eIF(iso)4E有關(guān)的抗病毒材料，則這幾個基因需同時喪失功能。截止目前，大白菜在上述兩個基因位點的突變及相關(guān)突變體檢測的標(biāo)記開發(fā)國內(nèi)外未見報道。鑒于此，有必要對我國豐富的大白菜抗/感TuMV材料中eIF4E和eIF (iso) 4E各個位點的多態(tài)性進行廣泛篩查，以發(fā)現(xiàn)各位點可能存在的突變類型；同時針對突變位點與野生型的序列差異，開發(fā)與突變體檢測有關(guān)的位點特異性分子標(biāo)記。有以下幾個方面的潛在益處① 可以將該標(biāo)記用于篩查大白菜種群，提供高效的大白菜突變體檢測手段；②當(dāng)其他位點發(fā)現(xiàn)突變類型時，可以采用同樣的方法開發(fā)標(biāo)記；③當(dāng)多個位點的突變位于不同的材料中時，可以通過標(biāo)記輔助選擇手段將多位點的突變聚合在一起，創(chuàng)造廣譜抗TuMV大白菜新種質(zhì)在培育廣譜抗TuMV大白菜新品種時，可以實現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇，提高育種效率。 由于這種標(biāo)記直接位于功能本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種大白菜eIF(iso)4E.c位點轉(zhuǎn)座子插入突變體，其特征在于：與野生型位點檢測相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM?4E.c?W，片段大小1216bp，如SEQ?ID?No.1所示；對應(yīng)的突變位點檢測相關(guān)的標(biāo)記命名為ASM?4e.c?I，片段大小4419bp，如SEQ?ID?No.2所示。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉栓桃，趙智中，張志剛，李巧云，盧金東，
申請(專利權(quán))人：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：