本發明專利技術涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明專利技術涉及一種蠟蚧菌發酵生產幾丁質酶的培養基及方法。所述培養基的原料配方為：5-15g/L果糖或麥芽糖，5-15g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8×10-4mol/LK+或Ca2+，0.05-0.2g/LVc或者VB6，其余為水，培養基初始pH=5.5-7.0。該方法通過將發酵種子液按接種于培養基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26℃，轉速160r/min下培養。本發明專利技術的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蠟蚧菌發酵生產幾丁質酶的培養基，具有幾丁質酶產率高，幾丁質酶活力高等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本專利技術涉及一種蠟蚧菌 Hecanicillium)發酵生產幾丁質酶的培養基及方法。
技術介紹
臘階菌Cl I Hum)隸屬絲孢菌類(Hyphomyce tes),廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶，能寄生蚧類、蚜蟲類、螨類和粉虱，還可寄生鱗翅目的一些害蟲及線蟲、薊馬等。 20世紀70年代以來，歐洲一些國家及美國、日本等國對利用蠟蚧菌防治溫室蔬菜害蟲給予極大重視。目前蠟蚧菌、座殼孢菌、擬青霉菌、綠僵菌和白僵菌等都是研究較多的昆蟲病原真菌，其中以綠僵菌和白僵菌幾丁質酶在國內外研究應用最為廣泛(肖燕等，2001 )，而對蠟蚧菌產幾丁質酶的研究在國內外并不多見。用蠟蚧菌發酵生產幾丁質酶可為將來真菌防治害蟲的深入研究提供科學依據。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供。本專利技術首先提供了一種蠟蚧菌發酵生產幾丁質酶的培養基，所述培養基的原料配方為5-15 g/L果糖或麥芽糖，5-15 g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8X10_4mol/L K+或 Ca2+，O. 05-0. 2 g/LVc 或者 VB6，其余為水，培養基初始 ρΗ=5· 5-7. O。更優選地，所述培養基的原料配方為10g/L麥芽糖，10g/L酵母浸膏，4X10_4mol/L Ca2+，O. lg/LVB6，，其余為水，培養基初始pH=5. 5。本專利技術還提供了一種蠟蚧菌發酵產幾丁質酶的方法，所述方法包含以下步驟 (a)將蠟蚧菌接種種子培養基，制得發酵種子液；(b)將步驟(a)中制得的發酵種子液按接種于權利要求1或2所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為50-100 mL，接種量5-15mL，于26°C，轉速160 r/min下培養。所述種子培養基的原料配方為200g/L土豆,葡萄糖20g /L,其余為水，自然pH。本專利技術采用的蠟蚧菌為蠟蚧菌Z.1ecanii FJ28 (邱君志等，金屬離子對蠟蚧菌幾丁質酶活力的影響，激光生物學報，2009年2月)。采用本專利技術優化后的培養基，菌齡I ld，發酵周期4d，發酵產生結果蠟蚧菌FJ28產幾丁質酶為25 U/mL以上。本專利技術的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于蠟蚧菌發酵生產幾丁質酶的培養基，具有幾丁質酶產率高，幾丁質酶活力高等優點。附圖說明圖1 NAG標準曲線。圖2不同碳源對產酶的影響。圖3不同維生素對產酶的影響。圖4不同氮源對產酶活性的影響。具體實施例方式本專利技術用下列實施例來進一步說明本專利技術，但本專利技術的保護范圍并不限于下列實施例。實施例1 單因素實驗確定培養基最優成分 實施步驟 (I)種子培養和基礎培養基的配制20% 土豆汁(土豆切片熬汁)1L，葡萄糖20g，自然pH。分裝于250mL的三角瓶，每個三角瓶含150mL。1. OlMPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對培養基預處理。基礎培養基(液體誘導培養基)粉狀幾丁質2%、KH2PO4 O. 1%、MgSCV7H20 O. 05%、NaCl O. 02%、pH6. 5。(2)發酵種子的制作將蠟蚧菌FJ28接種于馬鈴薯瓊脂培養基上，于26°C下培養5d，待其產孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養基，26°C，轉速160 r/min下培養4d，即為發酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定波長550nm處的吸光值。換算成酶活單位U/mL。(4)幾丁質酶酶活測定取ImL發酵上清液加入ImL磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· O)和50mL5%膠體幾丁質中(以不加膠體幾丁質的上清液作為對照),37°C水浴lh，加入2mL DNS試劑終止反應，沸水浴IOmin后冷卻，離心后取上清液在波長550nm下測紫外吸光度，計算出產生的N-乙酰氨基葡萄糖的含量。酶活力(U/g或U/mL) =AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數'N為反應試劑的總體積；η為酶液的稀釋倍數；t為反應時間；m為酶液質量或體積，g或mL)。(5)標準曲線的制作NAG標準曲線的制定在O 100 μ g/mL范圍內，以550nm處的吸光值為橫坐標(X)、N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的濃度為縱坐標(Y)制定標準曲線。具體步驟如下 a.用超純水配置濃度為 10、20、30、40、50、60、70、80、90 和 100 μ g/mL 的 NAG。b.取上述濃度的NAG溶液各ImL分別與2mL DNS顯色劑混合并沸水浴IOmin。c.反應完畢后，測定反應液在550nm處的吸光值，在上述反應體系中以超純水取代NAG為空白對照。試驗設置3個重復，其平均值用于制作標準曲線。根據待測樣的吸收值在標準曲線上找到相應NAG的量，便可計算出樣品中幾丁質酶的活性。結果見圖1。(6)不同碳源、氮源、維生素對產幾丁質酶的影響 (a)碳源對酶產量的影響，在基礎培養基中分別添加1%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-山梨醇、可溶性淀粉，接入相同的蠟蚧菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養，72h發酵液中幾丁質酶活性。結果見圖2。(b)在基礎培養基中分別添加O. 01% VB1, VB2、VB6、Vc, Ve，接入相同的蠟蚧菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養，72h檢測發酵液中幾丁質酶活性。結果見圖3。(c)氮源對酶產量的影響，在基礎培養基中分別添加1%的牛肉浸膏、酵母浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、KNO3> NH4Cl, (NH4)2SO4,〇&_3)2，接入相同的蠟蚧菌液，在261、16017^11的搖床中培養，72h檢測發酵液中幾丁質酶活性。結果見圖4。實施結果添加不同碳源(葡萄糖、鹿糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉)均提高了酶活性。其中添加麥芽糖使殺蟲蠟蚧菌FJ28產幾丁質酶活性達到17. 92U/mL(圖2);其次是添加果糖的處理， 產酶達到13. 17U/mL的高峰；添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖的處理相對前兩者其產酶活性要低得多，僅2. 8-5 U/mL。因此，不同碳源對蠟蚧菌FJ28產酶量影響不同。由此可見，麥芽糖是促進蠟蚧菌FJ28產幾丁質酶的最佳碳源。在添加的不同維生素處理中，與CK相比，Vb6最有助于蠟蚧菌FJ28提高產酶水平 (圖3)，Vc次之。添加其他維生素不利于提升蠟蚧菌FJ28所產幾丁質酶活性。在所添加的不同氮源中，添加酵母浸膏的處理最有助于提高產酶水平，產幾丁質酶酶活性達到5. 34U/mL(圖4)，而添加酵母浸粉、蛋白胨和KNO3的處理也提高產酶量，但較酵母浸膏處理的酶活低。此外，從提升幾丁質酶活性總體上看有機氮優于無機氮。據此，酵母浸膏是提高蠟蚧菌FJ28產幾丁質酶的最佳氮源。實施例2正交實驗確定最優發酵條件 (O正交實驗確定最佳培養基從單因素實驗確定的培養基的基礎上，改變各成分，和PH值，配置不同的培養基，方法同實施例1中步驟(1)、(2)。見表1，將相同量的接種量(10%)菌種接種于250mL，裝有50mL 培養液，在26°C，轉速160 r/min下培養培養4d。然后按實施例1步驟(3)、(4)測定酶活。 選取正交實驗最優結果和其產酶量最高的實驗組號，進本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蠟蚧菌發酵生產幾丁質酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料配方為：5?15?g/L果糖或麥芽糖，5?15?g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2?8×10?4mol/L?K+或Ca2+，?0.05?0.2?g/LVc或者VB6，其余為水，培養基初始pH=5.5?7.0。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：邱君志，蘇禮超，蔡志雄，涂潔，宋飛飛，邱云鋒，李小霞，何肖云，毛麗慧，謝小聰，
申請(專利權)人：福建農林大學，
類型：發明
國別省市：
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