一種1,4-β-D-木聚糖酶突變體制造技術

本發明專利技術屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及1,4-β-D-木聚糖酶突變體。本發明專利技術使用易錯PCR方法、DNA改組技術對該酶基因進行突變，再通過高通量篩選方法將正突變檢出。并結合基于序列比對的半理性設計方法確定部分潛在熱穩定相關位點，再通過定點突變方法得到熱穩定相關突變體。經上述突變文庫構建、篩選以及半理性設計方法，獲得5個熱穩定性顯著提高的突變體，其熱失活半衰期比野生型提高2-52倍，顯示出在造紙制漿、生物能源等工業上潛在的應用價值。

【技術實現步驟摘要】
,4-β-D-木聚糖酶突變體的制作方法
本專利技術屬于基因工程和酶工程領域，具體內容涉及耐熱性提高的l，4-13-D-木聚糖酶突變體。
技術介紹
木聚糖酶(endo-1, 4-β-xylanases, EC 3.2. 1.8)以內切方式水解木聚糖分子中的β -1, 4-糖苷鍵，生成低聚木糖和木糖，是半纖維素水解酶系中最關鍵的水解酶之一，在工業上具有重要的應用價值。自上世紀80年代木聚糖酶開始工業應用以來，木聚糖酶的應用領域不斷擴大，目前已經在飼料、制漿造紙、食品、能源等行業中得到廣泛應用。隨著木聚糖酶的應用范圍進一步拓展，工業上對其現有性能提出了更高的要求，如長時間內保持 活性穩定，在極端環境中保持高的活性(極端溫度或者PH值等)或者可以接受不同的底物(包括非天然底物)。其中酶的熱穩定性對于工業應用來說十分重要，而且高溫條件下，酶的反應速度更快，能縮短反應周期，節約成本，也有利于避免反應過程中被其他微生物污染。隨著蛋白質工程技術和分子生物學的發展，運用定向進化和理性設計的手段對酶分子進行人工進化和改造已成為當前酶工程領域研究的熱點。到目前為止，已有許多學者運用這項技術成功的改造了各種各樣的酶，取得了令人矚目的進展(Zhao，2007，Biotechnogy and Bioengineering 98 (2)，271-275)。其中易錯 PCR(error-prone PCR)、DNA改組(DNA shuffling)、半理性設計等已成為酶的分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白質的進化過程(Lehmann and ffyss, 2001 Current Opinion in Biotechnology12(4)，371-375)。
技術實現思路
本專利技術的目的在于采用定向進化技術同時結合基于序列比對的半理性設計方法對來源于Geobacillus stearothermophiIus的1，4_ β-D-木聚糖酶XT6進行分子改造,獲得熱穩定性提高的木聚糖酶突變體。為達到上述目的，本專利技術使用多輪易錯PCR方法、DNA改組技術對1，4-β- _木聚糖酶ΧΤ6基因進行突變，再通過高通量篩選方法將正突變檢出，同時使用半理性設計方法確定部分潛在熱穩定相關位點，再通過定點突變方法得到熱穩定相關突變體。本專利技術的具體實施方法為來源于G. stearothermophiIus (Genbank登錄號為Z29080)的木聚糖酶 XT6 由 379 個氨基酸組成(Lapidot, Mechaly et al.，1996Journal of Biotechnogy 51 (3), 259-264)(見 SEQ IDN0.1)。為迅速得到 XT6 全基因序列并提高其在大腸桿菌中的表達量，以利于對XT6酶分子的改造，根據已報道的XT6基因序列信息(Gat, Lapidot et al. , 1994 Applied and Environmental Microbiology60(6)，1889-1896)，采用基于PCR的全基因合成方法合成了木聚糖酶XT6全基因序列。同時根據大腸桿菌密碼子偏好性對其DNA序列進行優化(在線軟件DNAWorks，http://helixweb. nih. gov/dnaworks/,優化合成的的木聚糖酶XT6基因序列為SEQ ID NO. 2),功能正常的酶蛋白在大腸桿菌BL21-DE3中過量表達Zhang, Peiet al. , 2009 Chinese Journalof Applied and Environmental Biology 15 (2)，271-275)。米用易錯 PCR 方法、DNA 改組技術對其進行隨機突變，以PET 28a (+)載體構建高效突變庫，再將含有突變基因的質粒轉入表達宿主E. coli BL21-DE3中，挑選單克隆于96孔板中表達蛋白。離心重懸后，取部分菌液加入1%濃度木聚糖底物反應適當時間后，以DNS法終止反應，測定酶活性。同時，另取部分菌液熱處理一定時間，測定殘余活性。殘余活性高于對照的菌株轉接到新的96孔培養板中，進行重復篩選。將篩選得到的殘余活性高于對照的菌株，送上海英駿生物技術有限公司測序，獲得突變體DNA序列信息。詳細方案見實施例2。同時采用基于序列比對的半理性設計方法獲得熱穩定突變體((Lehmann, Loch etal. , 2002 Proteinengineering 15 (5), 403-411)。具體做法為，首先將XT6氨基酸序列與其 他不同來源的17條木聚糖酶氨基酸序列進行比對，初步確定有可能影響酶穩定性的位點，通過定點突變得到各個位點的單點突變體，測定其熱失活半衰期，并與野生型比較，得到酶熱穩定性的突變體F360L。詳細方案見實施例6。經上述對構建的突變文庫篩選以及半理性設計方法，獲得20個熱穩定性提高的突變體，分別為 IOE11、05D03、09D05、08A07、05R)3、04D08、04F06、04H09、08G01、06B01、04D03、03B11、04H12、02E04、06H07、F360L、FAM、FAMG, FTAMG 和 FC06T，序列信息見 SEQ IDNO. 3-N0. 22，其特征如下IOEll :該酶的第53位的苯丙氨酸突變為酪氨酸(DNA序列由TTT變為TAT)。05D03 :該酶的第257位的丙氨酸突變為纈氨酸(GCA變為GAT)、第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸(ATG變為ΑΤΑ)。09D05 :該酶的第121位的蘇氨酸突變為異亮氨酸(ACC變為ATC)、第364位的甘氨酸突變為天冬氨酸(GGC變為GAC)。08Α07 :該酶的第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸(ATG變為ΑΤΑ)。05F03 :該酶的257位的丙氨酸突變為纈氨酸(GCA變為GTA)、第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸(ATG變為ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突變為天冬氨酸(GGC變為GAC)。04D08 :該酶的第53位的苯丙氨酸突變為酪氨酸(TTT變為ΤΑΤ)、第73位的賴氨酸突變為異亮氨酸(AAA變為ΑΤΑ)、第257位的丙氨酸突變為纈氨酸(GCA變為GTA)、第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸(ATG變為ΑΤΑ)。04F06 :該酶的第53位的苯丙氨酸突變為酪氨酸(TTT變為ΤΑΤ)、第364位的甘氨酸突變為天冬氨酸(GGC變為GAC)、第380位的賴氨酸突變為蘇氨酸(AAA變為ACA)。04Η09 :該酶的第53位的苯丙氨酸突變為酪氨酸(TTT變為ΤΑΤ)、第257位的丙氨酸突變為纈氨酸(GCA變為GTA)、第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸(ATG變為ΑΤΑ)、第380位的賴氨酸突變為異亮氨酸(AAA變為ΑΤΑ)。08G01 :該酶的第53位的苯丙氨酸突變為酪氨酸(TTT變為ΤΑΤ)、第113位的谷氨酸突變為天冬氨酸(GAA變為GAT)、第257位的丙氨酸突變為纈氨酸(GCA變為GTA)、第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸(ATG變為ΑΤΑ)。06Β01 :該酶的第213位的蘇氨酸突變為異亮氨酸(ACT變為ATT)、第257位的丙氨酸突變為亮氨酸(GCA變為TTA)、第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸(ATG變為ΑΤΑ)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種1,4?β?D?木聚糖酶突變體，其特征在于：以SEQ?ID?NO.1所示的1,4?β?D?木聚糖酶XT6氨基酸序列為基礎，經突變后具有以下突變特征的氨基酸序列：將其第271位的蛋氨酸突變為異亮氨酸。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳中柳，張志剛，劉艷，
申請(專利權)人：中國科學院成都生物研究所，
類型：發明
國別省市：