修飾的米曲霉乳糖酶及其制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了修飾的米曲霉乳糖酶及其制備方法和應用。所述聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶的結構通式為：R1-NH-R2；其中，R1為活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；R2為去除一個氨基的米曲霉乳糖酶分子。本發明專利技術進一步公開了制備所述修飾的米曲霉乳糖酶的方法，該方法包括：將米曲霉乳糖酶溶液的pH值調節為酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物進行修飾反應得到聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶。本發明專利技術方法米曲霉乳糖酶轉化率高，所修飾得到的米曲霉乳糖酶酶活保持在85%以上，熱穩定性和抗酸能力有顯著提高，免疫抗原性有所降低，擴大了應用范圍。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及修飾的酶及其制備方法，尤其涉及修飾的米曲霉乳糖酶及其制備方法和應用，屬于米曲霉乳糖酶的修飾領域。
技術介紹
隨著人們生活水平的提高，健康的飲食習慣越來越受到重視，最明顯的表現就是乳及乳制品的消費量迅速增加。但是亞洲人口中約有70%的人患有不同程度的“乳糖不耐癥”，“乳糖不耐癥”在很大程度上限制了人們對乳及乳制品的攝入，會產生一系列不良影響，如引發鈣吸收不良、腹瀉、軟骨病和骨質疏松等，阻礙了乳工業的發展。利用乳糖酶降解乳糖目前是解決“乳糖不耐癥”的最佳處理方法。乳糖酶(Lactase)是一類催化特殊類型的糖苷鍵——β -半乳糖苷類化合物中 β -半乳糖苷鍵發生水解斷裂的酶。乳糖酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的轉移作用，在乳糖分子的半乳糖一側連接1-4個半乳糖，生成低聚半乳糖。米曲霉乳糖酶是胞外酶，發酵成本低，分離提取方便，而且較耐熱、耐酸，穩定性好。米曲霉乳糖酶屬高溫乳糖酶，最適作用溫度較高，一般在50°C以上，生產中能有效地防止雜菌的污染；反應速度快，反應時間短，酶的用量少，生產效率高。乳糖酶可廣泛應用于食品工業和醫藥工業。乳糖酶可以將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，可明顯提高乳制品的甜度，減少甜味劑的用量，降低乳制品中乳糖的含量，提高乳制品的可消化性。由于乳糖的溶解度較低，在冷凍乳制品中容易結晶析出，影響產品的質量，乳糖的降解可以克服乳制品中乳糖的析出問題，從而延長產品的貨架期。在發酵乳制作酸乳中添加乳糖酶，可以縮短發酵時 間，減少蔗糖用量，改善發酵乳的風味和口感。乳糖酶可以催化半乳糖基轉移反應，因此可以用于低聚半乳糖的生產，低聚半乳糖是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，能夠促進人體腸道內有益菌的增殖；促進礦物元素的吸收，特別是促進鈣的吸收；改善脂質代謝，降低血清中膽固醇的濃度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例。乳糖酶在醫藥工業中可做為助消化類藥物，適用于嬰兒各種消化不良癥，如先天性乳糖酶缺乏癥、由胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉、由感冒及消化不良等引起的繼發性腹瀉，特別是霉菌所產的乳糖酶耐酸性較強，不被胃酸分解，能夠到達小腸降解乳糖，緩解消化不良等癥狀。聚乙二醇(PEG)是一種惰性、兩親、不帶電荷的柔性長鏈高分子聚合物，是一種安全載體，PEG通過共價鍵與蛋白質連接，可以與蛋白質分子中的α-氨基、ξ_氨基反應對蛋白質分子進行修飾，通過對蛋白質表面氨基進行修飾以有效地改變蛋白質的生理特性。修飾后的蛋白質具有一些特殊的性質1、PEG化可以使蛋白質穩定性、抗酸能力、抗變性能力及抗蛋白酶水解能力提高；2、PEG化可以降低蛋白質的藥物抗原性，擴大應用范圍；3、PEG 化對酶活性影響不太，大多數酶活性損失不大。米曲霉乳糖酶分子量在90000Da左右，最適反應溫度為55°C，低溫下相對穩定， 4°C保存I個月后，酶活開始下降，高溫條件下穩定性較差，70°C保溫2h，殘留酶活力幾乎完全喪失，僅存5%左右；最適反應pH值為5. 5, pH值為4. O 8. O時相對穩定。在最適條件下，米曲霉乳糖酶活力為13000U/g。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是將米曲霉乳糖酶用聚乙二醇或其衍生物進行修飾得到修飾的米曲霉乳糖酶；本專利技術的目的之二是提供一種修飾米曲霉乳糖酶的方法；本專利技術的上述目的是通過以下技術方案來實現的聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶，其結構通式為=R1-NH-R2 ；其中，R1為活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；優選的，所述的活化的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇；所述的活化的聚乙二醇衍生物選自單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、 丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、單甲氧基聚乙二醇甲醛或單甲氧基聚乙二醇乙醛；其中，所述的聚乙二醇是直鏈的聚乙二醇或是帶支鏈的聚乙二醇，聚乙二醇的分子量為5000 20000 ；R2為去除一個氨基的米曲霉乳糖酶分子。本專利技術的另外一個目的是提供制備所述聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶的方法，該方法包括以下步驟 將米曲霉乳糖酶溶液的pH值調節為弱酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物進行修飾反應，得到聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶；本專利技術通過實驗發現，米曲霉乳糖酶溶液的pH值對于修飾反應的修飾率以及修飾后產物的相對酶活有較為明顯的影響；本專利技術通過大量的試驗發現，將米曲霉乳糖酶溶液的PH值調節為4. 5 7. 5時，能夠有效提升修飾率，修飾后的米曲霉乳糖酶也能保持較高的酶活；本專利技術通過進一步的實驗發現，當米曲霉乳糖酶溶液的pH值為5. O 6. O,尤其是5. 5時，不僅修飾率達到最高點，修飾的產物-米曲霉乳糖酶也能保持較高的酶活；為此， 本專利技術修飾反應中，米曲霉乳糖酶溶液的PH值優選為5. O 6. O,最優選為5. 5。本專利技術通過實驗發現米曲霉乳糖酶溶液的濃度對修飾效果影響不大，所以在修飾反應中米曲霉乳糖酶溶液的濃度可以根據反應的情況(例如所加入活化劑的濃度等)進行調整，作為參考，本專利技術修飾反應中的米曲霉乳糖酶溶液的濃度可以為500 5000U/mL，優選為 2000U/mL。本專利技術通過大量的試驗進一步發現，所加入的活化劑(活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)與米曲霉乳糖酶的摩爾比對于修飾反應的修飾率以及修飾后產物米曲霉乳糖酶的酶活有非常顯著的影響；本專利技術通過大量的篩選試驗發現，所加入的活化劑 (活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)與米曲霉乳糖酶的摩爾比為3 20 :1，修飾反應的產物具有較高的修飾率，產物也能保持較高的酶活；活化劑與米曲霉乳糖酶的摩爾比優選為15 20 :1，進一步優選為16 20 :1，特別優選為16 17 :1，在上述摩爾比范圍內，修飾率不僅有非常顯著的提升，修飾后的米曲霉乳糖酶也能保持較高的酶活，其中，當活化劑與米曲霉乳糖酶的摩爾比為16:1時，修飾后的米曲霉乳糖酶在相對酶活和修飾率之間達到了最佳平衡。所述的修飾反應的溫度優選為4 37°C，優選為20 25°C，最優選為25°C。所述的修飾反應的時間優選為10 120分鐘，優選為25 40分鐘，最優選為30分鐘。本專利技術進一步提供一種從上述修飾反應產物中分離和純化聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶的方法，該方法包括以下步驟將反應產物依次經過離子交換層析和凝膠過濾層析提純，去除游離的聚乙二醇 (PEG)和未反應蛋白，得到純化的聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶。所述的離子交換層析可以采用陽離子交換層析進行分離，使用的陽離子交換介質包括聚苯乙烯型、纖維素型、葡聚糖型、瓊脂糖型等，陽離子交換體積可以為6 600mL，流速可以為O. 5 50mL/min，用起始緩沖液平衡3 8倍柱體積，上液量為2 200mL，先用 I 5倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液、起始緩沖液+0 O. 4mol/LNaCl溶液，洗脫3 15倍柱體積；所述起始緩沖液可使用磷酸鹽緩沖液和醋酸鹽緩沖液等，PH值在4. 5 7. 5 ;收集各組分洗脫液，采用高效液相色譜分析各組分，合并聚乙二本文檔來自技高網...

【技術保護點】
聚乙二醇修飾的米曲霉乳糖酶，其特征在于，其結構通式為：R1?NH?R2；?其中，R1為活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；?R2為去除一個氨基的米曲霉乳糖酶分子。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙從波，陳文杰，馬清河，章淑艷，李軍，王云鵬，秦艷梅，
申請(專利權)人：河北省微生物研究所，
類型：發明
國別省市：