本發明專利技術提供了一種新型糖化酶及其重組表達工程菌，所述的酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1；并將篩選的糖化酶基因轉入里氏木霉（Trichoderma?reesei）中進行表達，構建了里氏木霉工程菌株。本發明專利技術所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表達，酶活水平達到148U/mL，為實現糖化酶的高密度發酵生產奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
一種糖化酶
本專利技術屬于微生物工程
，具體涉及一種糖化酶及用于表達該糖化酶的重組表達工程菌。
技術介紹
糖化酶,又稱葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase),它能把淀粉從非還原性未端水解 α -1. 4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解a-1. 6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖。同時也能水解糊精，糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作發酵培養基的各種抗生素、有機酸、氨基酸、維生素的發酵；本品還大量用于生產各種規格的葡萄糖。總之， 凡對淀粉、糊精必需進行酶水解的工業上，都可適用。我國高轉化率糖化酶市場發展迅速，產品產出持續擴張，國家產業政策鼓勵高轉化率糖化酶產業向高技術產品方向發展。2011年國內糖化酶的市場容量為5億元人民幣， 而且市場以每年20%速度在增長。預計2012年市場容量不低于6億元。糖化酶價格則自 2007年起不斷上漲，由2元/公斤漲到2. 7元/公斤。因此，國內企業新增糖化酶投資項目也逐漸增多。目前常用的糖化酶均是來自黑曲霉。自70年代中期開始，中科院微生物所篩選獲得了高產糖化酶菌株AS. 3. 4309。該菌株國內許多大型抗生素制藥廠、酒精廠、釀酒廠進行了生產規模試驗，均獲得成功。該項目的成功為我國發酵行業節約了大量的糧食，產生了巨大的經濟效益和社會效益。市場越來越密切關注高轉化率糖化酶，這使得克隆和表達高轉化率糖化酶成為研究的熱點之一。蛋白表達系統是黑曲霉，其產酶量(蛋白量)較高，但是受到糖化酶本身性質的影響，黑曲霉表達糖化酶的比活比較低，不能適應市場的需求。因此， 開發性能優良、比活高的糖化酶越來越受到各方 的關注。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種新型糖化酶及其重組表達工程菌，并將篩選的糖化酶基因轉入里氏木霉(Trichoderma reesei)中進行表達,為實現糖化酶的高密度發酵生產奠定了基礎。本專利技術一方面提供一種新型的糖化酶，所述的糖化酶包括I)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的糖化酶；2)在I)限定的氨基酸經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有糖化酶功能的，由I)衍生的蛋白質。用于編碼上述糖化酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2。本專利技術另一方面提供了一種表達載體，其包含上述編碼糖化酶的核苷酸。本專利技術另一方面提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述糖化酶基因的表達載體。上述表達宿主細胞為里氏木霉(Trichoderma reesei)。本專利技術所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表達，酶活水平達到148U/mL。所述糖化酶能從糖鏈的非還原端高效分解a -1, 4-糖苷鍵，因此，有望將其應用于全酶法生產葡萄糖的糖化過程。附圖說明圖1 :本專利技術構建的表達載體質粒圖譜。圖2 :里氏木霉工程菌發酵上清液的SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指為重組表達的糖化酶。具體實施例方式以下實施例是為了更好地說明闡述本
技術實現思路
，本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本專利技術。但是，本專利技術的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。 實施例1繩狀青霉(Penicillium funiculosum)糖化酶基因的克隆1.1總DNA的提取將繩狀青霉(購自中國普通微生物囷種保減管理中心，囷株編號3. 3791)過夜培養，取適量菌體置于離心管中，13000 rpm離心5 min，棄上清；加入400 抽提緩沖液(100mM Tris-HCl, IOOmMEDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，加入200iil IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm離心IOmin,取上清；加入2倍體積的無水乙醇，_20°C放置30min ；13000 rpm離心IOmin,棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。1. 2基因克隆以1.1中提取的基因組總DNA為模板進行PCR擴增，引物序列如下上游引物ATGGCTGTAACAGCTGCCTTGGCCG下游引物CTACTGCCAGCTATCGTTGATGCAGPCR。擴增條件為94°C 3min ；94°C 30S ；58°C 30S，72°C 2min 30 個循環；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。1. 3測序分析將1. 2中回收的擴增產物分別連接到pMD18 T-載體，相應的克隆載體分別命名為pT-Glu，轉化大腸桿菌DH5a。最后把陽性克隆送至北京華大基因研究中心進行測序分析。測序結果，擴增產物的基因序列為SEQ ID NO: 2，其編碼氨基酸序列為SEQ ID NO:1。多個不同克隆測序結果表明沒有出現擴增時的錯誤。經NCBI的BLAST比對發現,其核酸序列與Penicillium marneffei菌的糖化酶核酸具有87%同源性；該蛋白屬于15家族的糖水解酶，具有糖化酶保守催化和結構域，與Penicillium marneffei菌的糖化酶具有89%的同源性,證明本專利技術篩選的酶為新的，與已知酶來源不同的新的等位基因。實施例2里氏木霉工程菌的構建2.1表達載體構建以質粒pT-Glu 為模板，利用引物(ACGCGTCGACATGGCTGTAACAGCTGCCTTGGCCG 和 CGCGGATCCCTACTGCCAGCTATCGTTGATGCAG)進行 PCR 擴增，PCR 擴增條件是 94°C 3min ；94°C 30S ；58°C 30S,72°C 2min 30個循環；72°C 7min。擴增產物凝膠回收后，先進行Sal I和 BamH I雙酶切。同樣，對木霉表達質粒pKDN_EG也進行Sal I和BamH I雙酶切。用T4連接酶把雙酶切產物即克隆基因和表達載體22°C連接過夜。最后，把連接產物導入大腸桿菌 DH5a。相應的陽性克隆表達質粒命名為pVL-glu,質粒圖譜如圖1所示。2. 2原生質體制備接種里氏木霉菌絲于PDA平板上生長4天；切取直徑約3cm的菌落置于約60ml YEG (O. 5%酵母粉、1%葡萄糖)的液體培養基中，30°C，200 rpm振蕩培養過夜；多層紗布過濾收集菌絲;將菌絲置于盛有20 ml裂解酶液(O. 2g/10ml，0. 7 M NaCl溶解，Sigma L1412) 酶解2小時；取出酶解液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000 rpm，離心 10 min;棄上清,加5 ml溶液2懸浮,然后3000 rpm,離心10 min ;加適量溶液2懸浮分裝 (200 μ /管，IO8 個/ml)。2. 3轉化與驗證取10 ul pKDN-Glu DNA加入到200μ1原生質體中，接著加入50μ1 25%PEG溶液輕輕混勻，冰浴20min ;然后加入2 ml 25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置5min，把原生質體加到50 ml左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養基(O. l%MgS04, 1%KH2P04, O. 6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖，18. 3%山梨醇，O. 35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入含IOOPg/ ml潮霉素下層基礎培養基平板(2%葡萄糖，O. 5% (NH4) 2S04, 1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種糖化酶，所述的糖化酶包括：1）氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的糖化酶；2）在1）限定的氨基酸經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有糖化酶功能的，由1）衍生的蛋白質。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃亦鈞，劉士成，王華明，張慧丹，
申請(專利權)人：青島蔚藍生物集團有限公司，
類型：發明
國別省市：
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