本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種α淀粉酶及表達(dá)α淀粉酶的重組菌株，所述的α淀粉酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1，其編碼核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1。用于表達(dá)α淀粉酶的黑曲霉P11，其保藏編號為CGMCC?No.6513。本發(fā)明專利技術(shù)所得到的重組菌種能夠表達(dá)棒曲霉α淀粉酶AclaP11，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的淀粉酶的酶活力。同時，所得重組α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，擴大了AclaP11的應(yīng)用領(lǐng)域。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于淀粉酶的分離表達(dá)
，具體涉及一種來源于棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α淀·粉酶，以及該α淀粉酶在絲狀真菌宿主細(xì)胞(諸如黑曲霉(Aspergillus niger)中的異源表達(dá)。
技術(shù)介紹
α淀粉酶(E. C. 3. 2.1.1)能夠催化寡糖和多糖中的1，4_ α -糖苷鍵的內(nèi)水解，其以隨機的方式作用于淀粉、糖原以及相關(guān)多糖和寡糖，釋放出α構(gòu)型的還原基團(tuán)。目前α淀粉酶廣泛的用于多種工業(yè)用途，例如烘焙糕點、釀酒、玉米漿和乙醇生產(chǎn)以及醋發(fā)酵等領(lǐng)域。α淀粉酶的來源非常廣泛，可以從動物、植物和微生物中分離出來。其中微生物來源的淀粉酶具有來源豐富、性能多樣和易于工業(yè)化生產(chǎn)的特點，可滿足多種工業(yè)應(yīng)用需求，在工業(yè)上的應(yīng)用也最為廣泛。在現(xiàn)代工業(yè)的淀粉質(zhì)處理過程中，微生物淀粉酶的水解方法已經(jīng)徹底取代傳統(tǒng)的化學(xué)水解方法。雖然有多種微生物可以產(chǎn)生α淀粉酶，包括絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌等。但是，目前能夠滿足工業(yè)應(yīng)用需求的α淀粉酶主要來源于細(xì)菌和絲狀真菌，細(xì)菌α淀粉酶通常來源于芽孢桿菌屬(Bacillus)，真菌α淀粉酶通常來源于曲霉菌屬(Aspergillus)。其中由真菌產(chǎn)生的α淀粉酶即稱為真菌α淀粉酶。在目前已報道的文獻(xiàn)中，可以粗略的按酶學(xué)性質(zhì)或作用條件將真菌α淀粉酶分為3種類型(I)中性真菌α淀粉酶與細(xì)菌α淀粉酶不同，真菌α淀粉酶的來源相對較少，大多數(shù)真菌α淀粉酶的作用溫度和PH都比較溫和，如最適作用pH在5. O 5. 5之間，最適作用溫度為50 55°C左右，當(dāng)溫度超過60°C酶開始失活。目前商品化生產(chǎn)最多、應(yīng)用也最為廣泛的來源于米曲霉(變種)的α淀粉酶即屬于這一酶種。(2)耐熱或耐酸性真菌α淀粉酶此類酶在pH 2. 5 4. 5之間，作用溫度在超過60°C時仍具有良好的熱穩(wěn)定性。與中性真菌α淀粉酶相比，耐熱或耐酸性真菌α淀粉酶可以簡化液化、糖化過程，減少制糖等淀粉深加工過程中染菌幾率并降低相應(yīng)生產(chǎn)成本。這部分酶種目前工業(yè)上已經(jīng)開始生產(chǎn)使用，且具有很大的開發(fā)利用潛力。(3)具有生淀粉酶活力的真菌α淀粉酶該酶種除具有水解可溶性淀粉或其他糊化淀粉能力外，還具有生淀粉水解能力，在生料酒精行業(yè)的同步糖化發(fā)酵(SSF)中，與糖化酶配合使用，可以大幅度提高淀粉的利用速率和效率，并有效提聞酒精廣率。已報道有多種α淀粉酶基因在不同宿主中得到表達(dá)，其中真菌α淀粉酶基因的異源表達(dá)主要集中在真核表達(dá)系統(tǒng)。與原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)或芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)等)相比，真核表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)真核來源的異源蛋白時具有很大的優(yōu)勢，如翻譯后加工修飾(如糖基化、二硫鍵的形成)、內(nèi)含子的識別、信號肽的剪除和肽鏈的正確折疊與分泌等。此外，有多種真菌表達(dá)系統(tǒng)被美國FDA列為GRAS (generally recognized as safe)菌株，使得對一些食品或醫(yī)藥用異源蛋白的生產(chǎn)和應(yīng)用更易獲得相關(guān)機構(gòu)的認(rèn)可和批準(zhǔn)。目前，有大量來自曲霉屬(Aspergillus)的α淀粉酶已經(jīng)被報道并用于工業(yè)生產(chǎn)，但是僅有極少數(shù)文獻(xiàn)報道來源于棒曲霉(A. clavatus) α淀粉酶。本專利技術(shù)從棒曲霉中克隆得到了一種α淀粉酶，并在黑曲霉中克隆表達(dá)，且酶活力大大高于其在野生型中的酶活。另外，由于棒曲霉被認(rèn)為是有毒菌株，而黑曲霉則被認(rèn)為是安全菌(GRAS)，因此本專利技術(shù)擴大棒曲霉的應(yīng)用范圍(如食品領(lǐng)域)
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種α淀粉酶及表達(dá)α淀粉酶的菌株，以彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本專利技術(shù)篩選出的α淀粉酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，其一種編碼mRNA序列為 SEQ ID NO:2。在第二個方面，本專利技術(shù)涉及酶組合物，其包含上述的α淀粉酶。本專利技術(shù)另一個方面涉及用于表達(dá)上述α淀粉酶的曲霉菌株；一種表達(dá)α淀粉酶的黑曲霉(Aspergillus niger)Pll菌株，已于2012年9月4日保存在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌株編號為CGMCC No. 6513。本專利技術(shù)所得到的重組菌種能夠表達(dá)棒曲霉α淀粉酶AclaPll，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活(AclaPll在野生菌種無可檢測到的酶活)，且高于宿主菌黑曲霉自身表達(dá)的淀粉酶的酶活力。同時，所得重組α淀粉酶是由食品安全菌(GRAS)黑曲霉分泌所得，擴大了 AclaPll的應(yīng)用領(lǐng)域。附圖說明圖1 :本專利技術(shù)使用的pGm質(zhì)粒圖譜；圖2 :蛋白SDS-PAGE凝膠圖，顯示了黑曲霉轉(zhuǎn)化子的AclaPlI的表達(dá)情況，以及野生菌和宿主菌黑曲霉Gl的蛋白表達(dá)情況，其中泳道I所示為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，由左至右為116. OkD, 66. 2kD，45kD和35kD ;泳道2所示為黑曲霉宿主Gl在發(fā)酵5d后的蛋白表達(dá)情況；泳道3所示為野生菌的蛋白表達(dá)情況，其無可檢測到的蛋白表達(dá)。所示為泳道4AclaPll淀粉酶表達(dá)情況,在55kDa處可以看到清晰蛋白條帶。圖3 :黑曲霉轉(zhuǎn)化子表達(dá)的AclaPll的pH穩(wěn)定性；圖4 :黑曲霉轉(zhuǎn)化子表達(dá)的AclaPll的溫度穩(wěn)定性。具體實施例方式本專利技術(shù)用到了在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)等參考書中所記載的技術(shù)。但是，這并不意味著將本專利技術(shù)限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以選用已公開的技術(shù)來實施本專利技術(shù)實施例中記載的方案。除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本專利技術(shù)所屬領(lǐng)域的普通計數(shù)人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY,3nd Ed. (Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)為技術(shù)人員提供了本專利技術(shù)中所使用的許多術(shù)語的一般性解釋，具體如下如本文所用，術(shù)語“淀粉”指植物的復(fù)雜多糖碳水化合物構(gòu)成的任何物質(zhì)，包括具有(C6HltlO5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任何數(shù)字。具體而言，該術(shù)語指任何基于植物的物質(zhì)，包括但不限于谷物、草、塊莖和根，更具體而言，小麥、燕麥、玉米、黑麥、稻、高粱、糠、木薯、粟、馬鈴薯和甘薯。如本文所用，術(shù)語“ α淀粉酶”指催化1，4- α -糖苷鍵水解的酶。這些酶也被描述為在含有1，4-α -連接的D-葡萄糖單位的多糖中完成1，4- a -D-糖苷鍵的外切或內(nèi)切水解的酶。另一個用于描述這些酶的術(shù)語是“糖原酶(glycogenase) ”。如本文所用，術(shù)語“重組”當(dāng)被用于指代細(xì)胞、核酸、蛋白或載體是，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾，或者所述細(xì)胞來自于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在天然 (非重組)形式的該細(xì)胞中不曾發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)天然基因，但這些基因異常表達(dá)、表達(dá)不足或者完全不表達(dá)。如本文所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種α淀粉酶，其特征在于所述的α淀粉酶氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王華明，閆真，
申請(專利權(quán))人：天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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