一種寬pH作用范圍木聚糖酶及其應用制造技術

本發明專利技術提供一種寬pH作用范圍木聚糖酶XynA（EC?3.2.1.8)及其應用，屬于酶工程和基因工程領域。該木聚糖酶XynA來源于Streptomyces?sp.HJ，其最適pH5.5，pH穩定范圍3～11；最適溫度60℃，50℃半衰期為30h；Km和Vmax分別為3.45mg/mL，845.23μmol/min/mg。其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1，成熟蛋白436個氨基酸殘基。重組XynA在E.coli?BL21(DE3)中表達胞外酶活為213.5U/mL，是野生菌Streptomyces?sp.HJ酶活的11倍。XynA有較寬的pH作用范圍，尤其在堿性環境下，其可能在竹原纖維生物酶脫膠、紙漿漂白等行業具有潛在利用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種木聚糖酶及其應用，特別是一種寬pH作用范圍的木聚糖酶，屬于酶工程和基因工程領域。
技術介紹
木聚糖(Xylan) (EC 3. 2. I. 8)是植物細胞壁半纖維素組分的主要成分，占植物碳水化合物總量的三分之一。在自然界中，木聚糖是繼纖維素之后含量最為豐富的多聚糖。木聚糖的主鏈由多個毗喃木糖基通過β_1，4-糖苷鍵連結形成，側鏈含多種不同取代基。木聚糖酶屬于0-glycoside hydrolases(EC 3. 2. I. x),可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖單糖。它是一種復合酶，主要包括 endo-β-I, 4-xylanase (EC 3· 2· I. 8)和 β-xylosidase (EC3. 2. I. 37)。前者從主鏈內部隨機作用于β -I, 4-糖苷鍵，將木聚糖分解成低聚木糖；后者則作用于低聚木糖的末端，釋放出木糖單糖。目前已經發現的endo- β -I, 4-xylanase主要分布在5、7、8、10、11、43等家族的糖苷水解酶中，其中大部分屬于GH familylO和11兩大家族。GH familylO木聚糖酶通常含有兩個結構域，包括催化結構域和纖維素結合結構域(Cellulose Binding Domain:CBD), 相對分子質量一般大于30kDa，在結構上呈現“桶狀”;而GH familyll木聚糖酶多為單結構域，只含有催化結構域，相對分子質量一般小于30kDa，在空間結構上呈“右手半握狀”。迄今，已經有一些關于放線菌來源的木聚糖酶的報道，其中大部分為鏈霉菌， 如 Streptomyces sp. SffUlO, S. thermotrificans, S. lividans, S. olivaceoviridis E-68等等。現今一些來源于鏈霉菌的木聚糖酶在pH 10.0時已經沒有酶活，如來源于 Streptomyces sp.S9 的 XynAS9, Streptomyces sp. strain AMT-3 的 xylanase, Streptomyces sp. S2 7 的 xylanase, Streptomyces sp. SffUlO 的 XynSW2A/B ;而來源于 Streptomyces megaspores DSM 41476 的一個擁有寬 pH 的木聚糖酶 XYNAM6 在 ρΗ10· O 和11.O的殘留酶活也只有38%和15%。
技術實現思路
本專利技術所要解決的一個技術問題在于提供一種寬pH作用范圍穩定性的木聚糖酶，所述其氨基酸序列如以下I)或2)或3)所示I)其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示序列；2)在I)限定的氨基酸序列的基礎上氨基酸序列經過一個或者幾個氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列；3)與I)或2)限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。所述木聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述的木聚糖酶的寬pH作用范圍是指pH 4. 5 10. O。本專利技術所要解決的另一個技術問題是提供了一株含木聚糖酶的基因工程菌。本專利技術所要解決的另一個技術問題是提供了一種木聚糖酶基因工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟I)設計引物克隆木聚糖酶的基因xynA ；2).將基因克隆到重組表達載體上；3).將重組表達載體轉化到宿主細胞中。所述重組表達載體為pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一種。所述重組表達載體為pET_20b。所述宿主細胞為為細菌，酵母或真菌。所述細菌為E. coli BL21(DE3)、E. coli W3110、Ε· coli JM109、E. coli JM109(DE3)、Ε· coli DH5 α 中任意一種。本專利技術所述的木聚糖酶XynA的最適ρΗ5. 5,最適溫度60°C;有較寬的pH作用范圍， 尤其在堿性環境下pH4. 5 10. O范圍內相對酶活均在50%以上，pHll. O時仍有41%的酶活，比木聚糖酶XYNAM6的在堿性范圍內殘余酶活高；pH穩定范圍在3 11之間，殘余酶活力均在80%以上。重組XynA基因工程菌表達胞外酶活為213. 5U/mL,是野生菌Sti^ptomyces sp. HJ酶活的11倍。因此，在竹原纖維生物酶脫膠、紙漿漂白、食品等行業具有潛在利用價值。附圖說明 圖I純化所得XynA的SDS-PAGE圖。I、標準蛋白分子量；2、純化后樣品(XynA)。圖2 XynA的最適pH及pH穩定性曲線圖。圖3 XynA的最適溫度及溫度穩定性曲線圖。圖4重組XynA的發酵過程圖。■:大腸桿菌OD6tltl曲線；O :重組XynA的酶活曲線。圖5 重組 XynA 的 SDS-PAGE 圖。I、標準蛋白分子量；2、重組 XynA。具體實施方式實施例I :菌種的篩選和鑒定采用的竹塊為一年生毛竹，將竹材沿縱向截成50cm左右的長段，洗凈后浸入慪竹液中，室溫發酵一段時間。將Iml慪竹液在IOOml含木聚糖5g/L、(NH4)2SO4 O. 5g/L、酵母浸出液 O. 5g/L、MgSO4 · 7H20 O. 3g/L、K2SO4 O. lg/L、KH2PO4 I. Og/L、CaCl2 · 2H20 0. 2g/L、 微量元素溶液0. 5ml的培養基中37°C富集培養24h。然后將富集培養液以梯度稀釋的方法接種到含上述培養基成分的瓊脂培養皿中。在37°C培養2-4天后，挑單菌落至選擇培養基 (竹粉 20g/L、(NH4)2SO4 2. 5g/L、K2HPO4 O. 5/L、MgSO4 lg/L、瓊脂 20g/L)。在上述兩種培養基平板上都可以生長的菌落被選出進行發酵培養，選出可產木聚糖酶的優勢菌株。對選出的優勢菌株進行16S ribosomal DNA鑒定,鑒定結果顯不有一株優勢菌株與Streptomyces viridochromogenes (FJ790787)同源性達 99%,因此可確定為 Streptomyces species。將該產木聚糖酶的鏈霉菌命名為Streptomyces sp. HJ,并保藏。實施例2 Streptomyces sp. HJ的發酵及XynA的純化在含蛋白胨1%、酵母浸出液O. 5%、牛肉膏O. l%、NaCl O. 5%的種子培養基中接入一定量的Str印tomyces sp. HJ, 30°C, 200 rpm搖床培養24h后接含麩皮3%、蛋白胨O. 3%、酵母浸出液 O. 3%,KNO3 1%>KH2PO4 O. 05%、Na2HPO4 ·12H20 O. 05%、無水 MgSO4 O. 05%、Tween800. 1% 的發酵培養基，同樣條件培養3 4d后，離心收集上清即為粗酶液，酶活達到19U/mL。通過硫酸銨分級沉淀的方法確定40%(w/v)硫酸銨恰好使XynA完全鹽析。因此, 將發酵液上清緩慢加入40%(w/v)硫酸銨鹽析過夜，12，OOOXg, 40C，離心30min ;用適量緩沖液A (20mM醋酸-醋酸鈉，pH5. 0)將沉淀溶解，4°C透析過夜、膜過濾(0. 45 μ m)后即為上樣樣品。SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱(1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種寬pH作用范圍木聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列如以下1）或2）或3）所示：1）其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1所示序列；2）在1）限定的氨基酸序列的基礎上氨基酸序列經過一個或者幾個氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列；3）與1）或2）限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。

【技術特征摘要】
1.一種寬PH作用范圍木聚糖酶，其特征在于其氨基酸序列如以下I)或2)或3)所示 I)其氨基酸序列為SEQ ID NO. I所示序列； 2 )在I)限定的氨基酸序列的基礎上氨基酸序列經過一個或者幾個氨基酸取代、缺失或添加，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列； 3)與I)或2)限定的氨基酸序列具有90%以上同源性，且具有木聚糖酶活性的氨基酸序列。2.編碼權利要求I所述木聚糖酶的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。3.含有權利要求I或2所述木聚糖酶的基因工程菌。4.權利要求3所述基因工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟 1)設計引物克隆木聚糖酶的基因xyn...

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳敬，陳晟，何潔，宿玲恰，陳堅，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：