新纖維素酶基因制造技術

本發明專利技術的課題是從解纖維素枝頂孢分離了包含分類于內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的纖維素酶基因的基因組DNA，通過解析其堿基序列，確定了內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶基因。對已知的內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列進行了深入比較，發現了在解纖維素枝頂孢中也能夠保守的氨基酸序列，基于本信息設計了各種引物。使用這樣設計的各種引物，以基因組DNA或cDNA作為模板實施了PCR。其結果，得到了內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因片段，因而以本基因片段為基礎，設計引物，通過繼續進行PCR，擴增出9種內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因，解析了其堿基序列，從而完成了本發明專利技術。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及纖維素酶，具體涉及解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus) 來源的纖維素酶、編碼該纖維素酶的多核苷酸、利用了該多核苷酸的纖維素酶的制造方法及其用途。而且，在本說明書中，“多核苷酸”包括例如DNA或者RNA、或它們的修飾體或者嵌合體，優選為DNA。
技術介紹
纖維素酶是分解纖維素的酶的總稱，一般而言，微生物生產的纖維素酶中包括多種纖維素酶成分。纖維素酶成分根據其底物特異性可分為纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、 β -葡萄糖苷酶這3類,對于作為產生纖維素酶的絲狀真菌的黑曲霉(Aspergillus niger) 而言，可以認為其最多產生4種纖維二糖水解酶、15種內切葡聚糖酶、15種β -葡萄糖苷酶。因此，在對微生物產生的纖維素酶進行產業利用時，是以該微生物生產的各種纖維素酶成分的混合物的形式加以利用。絲狀真菌解纖維素枝頂孢的特點是生產糖化力強的纖維素酶(非專利文獻I)，有報告稱，其在飼料用途、 青貯飼料用途方面具有高有用性(專利文獻1-3)。此外，對其所含有的纖維素酶成分(專利文獻4-10)進行了詳細研究，已知其與其他絲狀真菌一樣分泌多種纖維素酶成分。可以認為，在限定于某種用途的情況下，多種纖維素酶成分中，特定的數種酶成分對其用途而言是重要的。因此，如果能夠根據利用的用途對微生物生產的纖維素酶進行纖維素酶成分組成的最適化，則可以期待獲得活性更高的纖維素酶。為止的最佳方法是通過基因重組方法導入特定的酶基因進行過度表達、或者缺損特定的酶基因。然而，對于解纖維素枝頂孢的情況，在多種纖維素酶成分中，僅分離出了 2種纖維二糖水解酶基因(專利文獻4、5)以及I種β-葡萄糖苷酶基因(專利文獻10)，現狀是，對于其他的纖維素酶無法利用基因導入進行表達增強、或者利用缺損進行表達抑制。在這樣的背景中，為了通過基因重組技術將解纖維素枝頂孢產生的纖維素酶的組成最適化，希望分離出內切葡聚糖酶、β_葡萄糖苷酶等多糖分解酶基因。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻 I !Agricultural and Biological Chemistry,(日本)，1987 年，第51 卷，p.65專利文獻專利文獻I :日本特開平7-264994號公報專利文獻2 :日本專利第2531595號說明書專利文獻3 :日本特開平7-236431號公報專利文獻4 :日本特開2001-17180號公報專利文獻5 :國際公開W097/33982號小冊子8專利文獻6 :國際公開W099/011767號小冊子專利文獻7 日本特開2000-69978號公報專利文獻8 :日本特開平10-066569號公報專利文獻9 :日本特開2002-101876號公報專利文獻10 日本特開2000-298262號公報
技術實現思路
專利技術所要解決的問題本專利技術的課題是通過從解纖維素枝頂孢分離出包含分類于內切葡聚糖酶、 β-葡萄糖苷酶的纖維素酶基因的基因組DNA，并解析其堿基序列，確定內切葡聚糖酶以及 β-葡萄糖苷酶基因。解決問題的方法
本專利技術為解決上述問題，對已知的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶的氨基酸序列進行了深入比較，發現了即使在解纖維素枝頂孢中也保守的氨基酸序列，并基于本信息設計了各種引物。使用這樣設計的各種引物，以基因組DNA或cDNA作為模板實施了 PCR。 其結果得到了內切葡聚糖酶以及β -葡萄糖苷酶的基因片段，因而基于本基因片段設計引物，繼續進行PCR，從而擴增出了 9種內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因，并進行了堿基序列解析，從而完成了本專利技術。S卩，本專利技術涉及選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質⑴包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 306位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的I 306位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 306位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質⑴包含SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 475位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的I 475位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 475位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質⑴包含SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的1 391位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的I 391位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的1 391位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質⑴包含SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的1 376位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的I 376位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的I 376位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的I 221位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO :10所述的氨基酸序列的f 221位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的f 221位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質⑴包含SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的1 319位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO :12所述的氨基酸序列的f 319位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的f 319位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質⑴包含SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的1 301位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的I 301位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的I 301位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質⑴包含SEQ ID NO 16所述的氨基酸序列的I 458位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO :16所述的氨基酸序列的I 458位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】

【專利技術屬性】
技術研發人員：橫山史和，
申請(專利權)人：明治制果藥業株式會社，
類型：
國別省市：