本發(fā)明專利技術(shù)涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝，更具體地，涉及一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基及方法。所述培養(yǎng)基的原料含有1w%可溶性淀粉或葡萄糖，1w%蛋白胨或酵母粉，4×10-4mol/LBa2+或Ca2+，0.01w%Vc或VB1，培養(yǎng)基初始pH=5.5-7.0。該方法通過(guò)將發(fā)酵種子液接種于所述培養(yǎng)基中，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26℃，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)。本發(fā)明專利技術(shù)的發(fā)酵方法具有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，具有幾丁質(zhì)酶產(chǎn)率高，幾丁質(zhì)酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基及工藝。更具體地，本專利技術(shù)涉及。
技術(shù)介紹
扁座殼孢placenta Berk, et Br.)是子囊菌門、糞菌綱、肉座菌目、麥角菌科、座殼孢屬的一個(gè)種，主要寄生在粉風(fēng)和介殼上，在南亞和東南亞等地方都有分布。在我國(guó)南方等省的自然生境和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中造成粉虱群流行病，從而可以控制粉風(fēng)類害蟲的發(fā)生與危害。幾丁質(zhì)酶在微生物中的分布情況，細(xì)菌中有粘質(zhì)沙雷氏菌，環(huán)狀芽孢桿菌，地衣芽 孢桿菌，斯氏假單孢菌，巨大芽孢桿菌，液化沙雷氏菌，液化腸桿菌，嗜水氣單孢菌等。放線菌中有灰色鏈霉菌，紅色鏈霉菌及其它一些未定種的鏈霉菌。真菌中有溜曲霉，球孢白僵菌，米曲霉和木霉等(關(guān)海寧等，2006)。從植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中都能獲取幾丁質(zhì)酶，但由于細(xì)菌具有快速生長(zhǎng)和易進(jìn)行基因操作的特性而倍受人們青睞。目前報(bào)道的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細(xì)菌類型很多(楊水英等，2007)。在真菌幾丁質(zhì)酶相應(yīng)領(lǐng)域也報(bào)道了一些研究結(jié)果。肖炎農(nóng)等對(duì)植物線蟲卵寄生真菌淡紫擬青霉{Paecilomyces lilacinus)幾丁質(zhì)酶研究,翟逸對(duì)萊氏野村菌(Nomuraea ri7ej^i)CQ031021幾丁質(zhì)酶的研究，張潔等球孢白僵Qieauvoriabassiana)^h\l\以麩皮蠶蛹粉(4:1)、蛋白胨lg/L作為產(chǎn)酶最適培養(yǎng)基，在7. 5 g培養(yǎng)基中接種3ml液態(tài)種子，自然pH下28°C培養(yǎng)2d，酶活可達(dá)最高，為126U/g (干培養(yǎng)基)。目前，對(duì)蟲生真菌幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用主要集中在對(duì)害蟲的生物防治和幾丁質(zhì)、殼聚糖等生物資源的開(kāi)發(fā)利用方面。在生物防治方面，主要通過(guò)基因工程方法來(lái)克隆表達(dá)一些具有很強(qiáng)的致病作用的真菌幾丁質(zhì)酶，或者通過(guò)將蟲生真菌幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建轉(zhuǎn)化到植株中來(lái)提高植物對(duì)蟲害的抗性，在這兩方面都已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。國(guó)內(nèi)、外已經(jīng)對(duì)很多蟲生真菌的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行了克隆，特別是白僵菌、綠僵菌和蠟蚧菌的幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)出良好的致病性作用。這些研究的目的是為了解決昆蟲病原真菌殺蟲速率緩慢的弱點(diǎn)，以期從分子生物水平上提高菌株的殺蟲毒力，在最大程度上發(fā)揮真菌在害蟲控制上的優(yōu)勢(shì)及潛力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供。本專利技術(shù)首先提供了一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的原料含有l(wèi)w%可溶性淀粉或者葡萄糖，lw%蛋白胨或者酵母粉，4X 10_4mol/L Ba2+或者Ca2+，0. 01w%Vc 或者 VB1,培養(yǎng)基初始 pH=5. 5-7. O。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的原料按重量分?jǐn)?shù)計(jì)，lw%可溶性淀粉，1 %蛋白胨，4X l(T4mol/L Ba2+，0. 01w%Vc,培養(yǎng)基初始 pH=7. O。其次，本專利技術(shù)還提供了一種扁座殼孢發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的方法，所述方法包含以下步驟(a)將扁座殼孢接種種子培養(yǎng)基，制得發(fā)酵種子液； (b)將步驟(a)中制得的發(fā)酵種子液接種于所述的培養(yǎng)基，250mL的三角瓶裝液量為50mL，接種量15mL，于26°C，轉(zhuǎn)速160 r/min下培養(yǎng)。所述種子培養(yǎng)基的原料含有200g/L 土豆,葡萄糖20g/L,自然pH。本專利技術(shù)采用的座殼孢為扁座殼孢(何學(xué)友等，油茶黑膠粉虱及扁座殼孢對(duì)其自然控制作用，中國(guó)森林病蟲，2011年7月)。采用本專利技術(shù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基，菌齡4d，發(fā)酵周期4d，發(fā)酵產(chǎn)生結(jié)果扁座殼孢產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶活為4. OU/mL以上。本專利技術(shù)的發(fā)酵方法有發(fā)酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，具有幾丁質(zhì)酶產(chǎn)率高，幾丁質(zhì)酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。 附圖說(shuō)明圖1為NAG標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖2為不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響； 圖3為不同氮源對(duì)產(chǎn)酶活性的影響。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本專利技術(shù)，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。實(shí)施例1 單因素實(shí)驗(yàn)確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分 (I)種子培養(yǎng)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制土豆200g,葡萄糖20g,蒸懼水定容至IOOOmL,自然pH,分裝于250mL的三角瓶，每個(gè)三角瓶含150mL。1. OlMPa,滅菌20min。(2)發(fā)酵種子的制作將扁座殼孢接種于土豆瓊脂培養(yǎng)基上，于25°C下培養(yǎng)5d，待其產(chǎn)孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養(yǎng)基，26°C，轉(zhuǎn)速160r/min下培養(yǎng)4d，即為發(fā)酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)中的發(fā)酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液，待用。按酶活性測(cè)定在波長(zhǎng)550nm處測(cè)定吸光值。換算成酶活單位U/mL。(4)幾丁質(zhì)酶酶活測(cè)定取ImL發(fā)酵上清液加入ImL磷酸鹽緩沖液(0. 2mol/L)(pH7. 0)和50mL 5%膠體幾丁質(zhì)中(以不加膠體幾丁質(zhì)的上清液作為對(duì)照)，37°C水浴lh，力口入2mL DNS (二硝基水楊酸)(濃度為0. 025 mol/L，下同)試劑終止反應(yīng)，沸水浴IOmin后冷卻，離心后取上清液在波長(zhǎng)550nm下測(cè)紫外吸光度，計(jì)算出產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖的含量。酶活力(U/g或U/mL)=AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數(shù)；V為反應(yīng)試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間；m為酶液質(zhì)量或體積，g或mL)。(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作N-乙酰葡萄糖胺(NAG)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定在0 100 y g/mL范圍內(nèi)，以550nm處的吸光值為橫坐標(biāo)(X)、N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的濃度為縱坐標(biāo)(Y)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體步驟如下a.用超純水配置濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90 和 100 u g/mL 的 NAG ；b.取上述濃度的NAG溶液各ImL分別與2mLDNS顯色劑混合并沸水浴IOmin ；C.反應(yīng)完畢后，測(cè)定反應(yīng)液在550nm處的吸光值，在上述反應(yīng)體系中以超純水取代NAG為空白對(duì)照。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，其平均值用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣的吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到相應(yīng)NAG的量，便可計(jì)算出樣品中幾丁質(zhì)酶的活性。結(jié)果見(jiàn)圖1。(6)不同碳源、氮源對(duì)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響 (a)碳源對(duì)酶產(chǎn)量的影響，在粉狀幾丁質(zhì)2% (w/v)、KH2PO4 0.1 w %,MgSO4 7H20 0. 05w %、NaCl 0. 02 w %、pH6. 5的培養(yǎng)基中分別添加1%的蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、麥芽糖、膠體幾丁質(zhì)、L-阿拉伯糖、海藻糖，分別接入5mL的扁座殼孢菌液，在26°C、160r/min的搖床中培養(yǎng)4d，檢測(cè)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖2。(b)氮源對(duì)酶產(chǎn)量的影響，在粉狀幾丁質(zhì)2% (w/v)、KH2PO4 0.1 w %、MgSO4 7H200. 05 w %、NaCl 0. 02 w %、pH6. 5的培養(yǎng)基中分別添加1%的酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸膏、干酪素、KN03、(NH4)2S04、NH4C1 Xa(NO3)2，分別接入 5mL 的扁座殼孢菌液，在 26°C、160 r/min的搖床中培養(yǎng)4d，檢測(cè)發(fā)酵液中幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果見(jiàn)圖3。 結(jié)果 碳源對(duì)酶產(chǎn)量的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖2分析，不同碳源對(duì)扁座殼孢產(chǎn)幾丁質(zhì)酶有不同的影響，不同處理產(chǎn)酶活性分別是葡萄糖1. 39 U/mL、可溶性淀粉1. 35 U/mL、麥芽糖0. 70 U/mL、L-阿拉伯糖0.59 U/mL，最低的是海藻糖酶活本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種扁座殼孢發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的原料含有1w%可溶性淀粉或葡萄糖，1w%蛋白胨或酵母粉，4×10?4mol/L?Ba2+或Ca2+，0.01w%Vc或VB1，培養(yǎng)基初始pH=5.5～7.0。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：邱君志，蘇禮超，李小霞，涂潔，宋飛飛，邱云鋒，郭慶豐，何肖云，毛麗慧，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：福建農(nóng)林大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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