一種制備α1-抗胰蛋白酶的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種制備α1-抗胰蛋白酶的方法，它包括如下步驟：a.沉淀溶解b.PEG沉淀；c、病毒滅活；d、純化；e.超濾；f、純化；g.超濾透析；i.除菌分裝,凍干。本發(fā)明專利技術(shù)方法采用改良Kistler和Nitschmann法工藝的廢棄組分沉淀FIV來制備α1-抗胰蛋白酶，既解決了長(zhǎng)期困擾的K-N工藝或其改良工藝制備α1-抗胰蛋白酶的難題，實(shí)現(xiàn)了血漿資源的綜合利用，又對(duì)血漿蛋白主體分離工藝無干擾影響，PEG4000用量少，操作體積小，不使用離心設(shè)備，簡(jiǎn)化工藝，節(jié)省設(shè)備投入具備了很好的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及運(yùn)用改良K-N法組份IV沉淀制備人α1-抗胰蛋白酶的方法，屬血漿蛋白領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
α1-抗胰蛋白酶(Alpha-lantitrypsin AAT)。分子由394個(gè)氨基酸組成，分子量為52000的糖蛋白，以天然有活性及變性無活性兩種形式存在，由肝臟產(chǎn)生，主要功能為抑制胰蛋白酶和中性白細(xì)胞的彈性蛋白酶的活性，還可抑制糜蛋白酶，纖維蛋白溶酶等， 為人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的酶抑制劑之一。AAT先天性缺乏如基因突變或后天因素如長(zhǎng)期吸煙或細(xì)菌感染會(huì)造成AAT活性中心失活，都會(huì)導(dǎo)致AAT功能性不足進(jìn)而造成機(jī)體蛋白酶與抗蛋白酶系統(tǒng)失衡，肺組織抵抗彈性蛋白酶的能力下降，引起肺泡變形及末端小支氣管以及下肺空間擴(kuò)張等肺組織的慢性損害，會(huì)發(fā)生泡性肺氣腫，慢性阻塞性肺病(C0PD)，成人呼吸道窘迫癥(ARDS)，現(xiàn)階段美國(guó)FDA批準(zhǔn)的臨床適應(yīng)癥為α1-抗胰蛋白酶遺傳性缺乏引起的肺氣腫，臨床上一直就存在著采用AAT制劑進(jìn)行增補(bǔ)治療的需求。由于α1-抗胰蛋白酶自身具備抗炎，抗感染以及抗自身免疫反應(yīng)等多功能特性，故在炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease IBD),脂膜炎,脈管炎,鼻竇炎,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,糖尿病I型,糖尿病所引起足病，囊性纖維化(粘滯癥)，支氣管擴(kuò)張，肌纖維痛，某些皮膚病像牛皮癬等常見慢性疾病具備潛在治療價(jià)值。國(guó)外公司在進(jìn)行擴(kuò)大適應(yīng)癥方面的嘗試并取得了進(jìn)展，擴(kuò)大的適應(yīng)癥為支氣管擴(kuò)張(Bronchiectasis)和囊 性纖維化疾病(Cystic fibrosis),糖尿病I型。另有國(guó)外公司采用基因重組技術(shù)基于釀酒酵母系統(tǒng)表達(dá)的重組α — I抗胰蛋白酶rAAT，劑型為膠體，進(jìn)行了特應(yīng)性皮膚病的臨床試驗(yàn)。rAAT也在進(jìn)行針對(duì)其它皮膚炎癥，例如銀屑病以及中耳炎的臨床前研究。至今國(guó)內(nèi)沒有商品供應(yīng)臨床治療需要。開發(fā)AAT能有利于寶貴的血漿資源的綜合利用，極大地提升血漿蛋白生產(chǎn)的附加利潤(rùn)。因此開展AAT的研發(fā)不僅有很好的經(jīng)濟(jì)效益而且會(huì)有極佳的社會(huì)效益。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及專利報(bào)道α1-抗胰蛋白酶劑提純?cè)铣镃ohn法組分IV-1。 科恩等 Coan et al -Preparation and Properties of Alpha1-Proteinase Inhibi tor Concentrate from Human Plasma Vox Sang. 48:333-342 (1985)發(fā)表的米用 Cohn 法組分IV -1為原料，兩步PEG沉淀，第一步為11. 5%為去除雜蛋白，第二步28%為富集沉淀α1-抗胰蛋白酶，再經(jīng)一步DEAE-Sepharose CL-6B層析，巴氏法病毒滅活，該制劑含有12%白蛋白，2. 5%IgA,具備生物活性即抑制豬彈性蛋白酶(PPE活性)的AAT僅占總蛋白含量的60%，基于此工藝，美國(guó)Bayer公司開發(fā)出全世界第一個(gè)α 1_抗胰蛋白酶產(chǎn)品 PlOlastiη海因等 Hein et al !Production of Alpha 1-Proteinase inhibitor (Human) Eur· RespirJ.9:16s-20s(1990)發(fā)表的工藝采用Cohn法組分IV -1為原料，采用PEG沉淀和陰離子交換層析，最終產(chǎn)品的純度為60%。朱威等α1-抗胰蛋白酶制劑的制備及其病毒滅活，中國(guó)生物制品雜志，2001，14 (2) =97-101發(fā)表了 Cohn法組分IV抽提液經(jīng)兩次沉淀，第一次去雜，第二次富集α1-抗胰蛋白酶及離子交換批量吸附及凝膠過濾純化α1-抗胰蛋白酶，工藝中僅采用一次病毒滅活，采用的是巴氏法。有改為兩步病毒滅活措施的必要， 并且工藝中有PEG4000用量大的缺陷。萊賓等Lebing et al :美國(guó)專利No. 6，462，180: 采用Coan IV -1為原料,經(jīng)PEG沉淀,再經(jīng)兩步離子交換層析。病毒滅活方法采用去污劑 (Tween20),納米過濾，凍干后干熱病毒滅活，此專利技術(shù)中病毒滅活工藝較為繁復(fù)，可以進(jìn)一步優(yōu)化。卜鳳榮等專利申請(qǐng)?zhí)?00610103642.X，專利技術(shù)名稱α1-抗胰蛋白酶的制備方法，公開了采用組分IV -1為原料，提取α1-抗胰蛋白酶，病毒滅活方法為S/D病毒滅活和巴氏消毒法的組合，但制備采用PEG沉淀加一步陰離子交換層析，純度還達(dá)不到高純的標(biāo)準(zhǔn)。隨著國(guó)內(nèi)血衆(zhòng)蛋白分離技術(shù)的發(fā)展，Kistler與Nitschmann法及其改良法也廣泛地為國(guó)內(nèi)廠家所采用。改良Kistler和Nitschmann法(簡(jiǎn)稱改良K-N法)確實(shí)提升了主要血漿蛋白制品白蛋白的收率。但也造成了一些問題，一些重要的血漿蛋白制品如α1-抗胰蛋白酶等制備困難。采用Cohn法離心工藝處理I噸血衆(zhòng)可得17-20kg FIV-1蛋白沉淀,而改良Kistler與Nitschmann法處理I噸血衆(zhòng)可得IOOkg FIV沉淀(其中50kg蛋白沉淀和 50kg助濾劑)，由此可見,采用改良Kistler與Nitschmann法的FIV沉淀中的雜蛋白含量遠(yuǎn)高于Cohn法FIV-1沉淀，故純化難度也高出許多。國(guó)際上有一些廠家及研究者，如法國(guó)伯爾諾夫等Burnouf et al ^'Biochemical and Biological Properties of ana 1-antitrypsin Concentrate，，VoxSang 52:291-297(1987)應(yīng)用Kistler與Nitschmann法的組份A或組份A+ I上清經(jīng)層析柱進(jìn)行分離純化α1-抗胰蛋白酶，該方法存在對(duì)設(shè)備要求較高，需要大規(guī)模的層析系統(tǒng)及配套設(shè)施，操作時(shí)間較長(zhǎng)，病毒滅活不充分等缺陷。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述問題,本專利技術(shù)運(yùn)用改良Kistler和Nitschmann法工藝的廢棄沉淀 FIV來純化制備α1-抗胰蛋 白酶，提供了一種制備α 1_抗胰蛋白酶的方法。本專利技術(shù)提供了，它包括如下步驟a.沉淀溶解采用低溫乙醇法中的改良K-N法組份IV沉淀(按專利號(hào) ZL03135795. 4，名稱“一種血漿蛋白分離方法”所述的方法制備)溶解于8_12倍體積的 PH8. 1-9. O的緩沖液中，常溫分散攪拌I小時(shí)，30-40°C加熱攪拌I小時(shí)，常溫?cái)嚢?_14小時(shí)，整個(gè)溶解過程6-16小時(shí)，得溶解液；b. PEG沉淀將a步驟溶解液冷至5°C，加入PEG3000-6000濃度為6-10% (g/ml)， 攪拌，用酸調(diào)整PH值至5. 05-5. 35，加入1. 0-2. 0%助濾劑，攪拌過濾得到PEG上清液，濾液用堿調(diào)到ρΗ7· O ；C、病毒滅活S/D法；S/D病毒滅活完成后用等體積緩沖液進(jìn)行稀釋終止來保存 α1-抗胰蛋白酶的生物活性；d、純化采用陰離子交換層析純化；e.超濾;f、純化采用陽離子交換層析純化；g.超濾透析；h. 15nm 納米過濾；1.除菌分裝，凍干。其中，所述的步驟a還包括將攪拌后溶解液棄去沉淀，在上清液中加入2-3%助濾劑，邊攪拌邊進(jìn)行壓濾得濾液，超濾濃縮至約濾液體積的1/6-1/7，濃縮后蛋白濃度控制在 5. 1-6. 0%得超濾濃縮液，再進(jìn)行b步驟PEG沉淀。其中，S/D病毒滅活為采用1%了界661180/0.39^他？，在24±11，6小時(shí)，5/1)病毒滅活完成后用等體積緩沖液進(jìn)行本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種制備α1?抗胰蛋白酶的方法，其特征在于：它包括如下步驟：a.沉淀溶解：采用低溫乙醇法中的改良K?N法組份Ⅳ沉淀溶解于8?12倍體積的pH8.1?9.0的緩沖液中，常溫分散攪拌1小時(shí)，30?40℃加熱攪拌1小時(shí)，常溫?cái)嚢??14小時(shí)，得溶解液；b.PEG沉淀：將a步驟溶解液冷至5℃，加入PEG3000?6000，PEG濃度為6?10%（g/ml），攪拌1小時(shí)，用酸調(diào)整pH值至5.05?5.35，加入1.0?2.0%助濾劑，攪拌過濾得到濾液，濾液用堿調(diào)到pH7.0；c.病毒滅活：用S/D法滅活；d.純化：采用陰離子交換層析純化；e.超濾；f.純化：采用陽離子交換層析純化；g.超濾透析；h.15nm納米過濾；i.除菌分裝,凍干。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡駿，李澤林，劉波，初毅波，鄧紅，吳強(qiáng)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：