本發(fā)明專利技術(shù)涉及螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法，將螺旋藻粉懸濁液采用反復(fù)凍融法結(jié)合機(jī)械破碎法處理得到螺旋藻細(xì)胞破碎液；采用30%和50%硫酸銨溶液分級(jí)鹽析沉淀螺旋藻細(xì)胞破碎液得到藻藍(lán)蛋白粗提液1；加入PEG20000和NaCl進(jìn)一步沉淀出較高純度的藻藍(lán)蛋白粗提物；用磷酸鹽緩沖液溶解藻藍(lán)蛋白粗提物，制得藻藍(lán)蛋白粗提液2；藻藍(lán)蛋白粗提液2進(jìn)而用PEG20000/Na2SO4雙水相體系萃取，萃取后的下相經(jīng)過透析除鹽可得藻藍(lán)蛋白精提液，冷凍干燥制備藻藍(lán)蛋白成品。本發(fā)明專利技術(shù)提取工藝簡單、成本低，適于間歇性和規(guī)模化生產(chǎn)加工高純度、高收率的螺旋藻藻藍(lán)蛋白成品。本發(fā)明專利技術(shù)制得的藻藍(lán)蛋白粗提物可長時(shí)間貯存，進(jìn)一步純化制備的藻藍(lán)蛋白成品具有良好的抗氧化自由基清除效果和熒光強(qiáng)度。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及天然產(chǎn)物深加工
，具體涉及。
技術(shù)介紹
螺旋藻中包含多種生物活性物質(zhì)，其中藻膽蛋白在螺旋藻干粉中含量豐富(占15-25，w/w%)，并具有重要的醫(yī)藥、保健、生物工程等方面應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于我國螺旋藻產(chǎn)業(yè)中普遍養(yǎng)殖的鈍頂螺旋藻品系而言，其藻膽蛋白成分主要包含藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白，二者在藻膽蛋白中的含量比例約為3 :1，其中藻藍(lán)蛋白由于含量上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(約占螺旋藻干粉的10-20，w/w%)致使其研究應(yīng)用更為普遍。藻藍(lán)蛋白不但在保健食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有抗輻射、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)造血和延緩衰老等功能，據(jù)其純度的不同更廣泛地被應(yīng)用于熒光探針和天然色素等生物工程、食品科學(xué)和精細(xì)化工等領(lǐng)域。然而由于螺旋藻藻膽蛋白中 的藻藍(lán)蛋白分子和別藻藍(lán)蛋白分子的亞基之間氨基酸序列同源性很高，造成藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白難以分離的技術(shù)瓶頸。目前螺旋藻藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的分離純化通常采用羥基磷灰石介質(zhì)進(jìn)行層析分離，但存在吸附性弱、洗脫時(shí)間長、上樣量少等問題，并且還需結(jié)合其它多步層析操作如體積排阻層析和離子交換層析等進(jìn)一步提高藻藍(lán)蛋白純度。也有報(bào)道可通過反復(fù)鹽析操作或雙水相萃取技術(shù)，提高藻膽蛋白的純度，無需多步層析操作，但多步提取操作同樣存在產(chǎn)品收率低，操作周期長等問題，尤其對(duì)具有熒光特性的藻藍(lán)蛋白，其熒光特性易在長時(shí)間的提取操作過程中損失。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法，該方法通過硫酸銨分級(jí)鹽析、PEG20000-NaCl聚合物沉淀制得的藻藍(lán)蛋白粗提物可長時(shí)間貯存藻藍(lán)蛋白并保持其生物及熒光活性，進(jìn)一步結(jié)合雙水相萃取分離可獲得高純度的、具有抗氧化活性和熒光特性的藻藍(lán)蛋白成品。本專利技術(shù)的螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法包括如下步驟( I)制備螺旋藻粉懸濁液取螺旋藻粉溶解于磷酸鹽緩沖液中，制得螺旋藻粉懸濁液；(2)制備螺旋藻細(xì)胞破碎液將螺旋藻粉懸濁液采用反復(fù)凍融法結(jié)合機(jī)械破碎法處理，離心取上清，得到螺旋藻細(xì)胞破碎液；(3)制備藻藍(lán)蛋白粗提液1:采用30%和50%硫酸銨溶液分級(jí)鹽析沉淀螺旋藻細(xì)胞破碎液，透析除鹽，得到藻藍(lán)蛋白粗提液I ;(4)制備藻藍(lán)蛋白粗提物將PEG20000和NaCl溶解至藻藍(lán)蛋白粗提液1，配制成PEG20000-NaCl沉淀體系，靜置、離心取沉淀，得到藻藍(lán)蛋白粗提物。本專利技術(shù)的螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法還包括如下步驟(5)制備藻藍(lán)蛋白粗提液2 :用磷酸鹽緩沖液溶解藻藍(lán)蛋白粗提物，制得藻藍(lán)蛋白粗提液2 ；(6)制備藻藍(lán)蛋白精提液采用PEG20000/Na2S04雙水相體系雙水相萃取藻藍(lán)蛋白粗提液2，分配平衡、離心分相，取下相，透析除鹽，制得藻藍(lán)蛋白精提液；(7)冷凍干燥制備藻藍(lán)蛋白成品。其中，步驟(I)中螺旋藻粉與磷酸鹽緩沖液的比例為ImL磷酸鹽緩沖液對(duì)應(yīng)0. 04-0. 05g螺旋藻粉。所述磷酸鹽緩沖液為0. 01mol/L, pH=7的磷酸鹽緩沖液。其中，步驟(2)為將螺旋藻粉懸濁液采用反復(fù)凍融法結(jié)合機(jī)械破碎法反復(fù)操作三次，離心取上清，制得螺旋藻細(xì)胞破碎液； 反復(fù)凍融法結(jié)合機(jī)械破碎法反復(fù)操作三次的步驟為將螺旋藻粉懸濁液置于4-1 (TC下靜置4-8h后至-15—25 °C冰凍，將冰塊絞碎，再次4-1 (TC至-15—25 °C反復(fù)凍融與機(jī)械破碎直至反復(fù)操作三次；離心的轉(zhuǎn)速為6000-9000rpm，時(shí)間為20_30min。其中，步驟(3)中硫酸銨溶液分級(jí)鹽析沉淀的方法為先將硫酸銨溶解至螺旋藻細(xì)胞破碎液至30%飽和度，4-10°C靜置12-15h，9000-12000rpm下離心20_30min取上清，再向上清中溶解硫酸銨至50%飽和度，4-10°C靜置12-15h，9000-12000rpm下離心20_30min取沉淀；透析除鹽的步驟為將沉淀溶解于磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行透析30_40h，換5-7次透析液。其中，步驟(4)中所述PEG20000_NaCl沉淀體系的組分為20%(w/v)PEG20000和0. 8mol/LNaCl ;靜置為 4_10°C靜置 12_15h，離心為 9000_12000rpm 下離心 20_30min。其中，步驟(5)為用0. 01mol/L, pH=7. 0的磷酸鹽緩沖液溶解藻藍(lán)蛋白粗提物；其中，步驟(6 )中所述PEG20000/Na2S04雙水相體系的組分包含10. 5% (w/w)PEG20000，5. 9%(w/w) Na2SO4 和 0. 2mol/LNaCl ;分配平衡 l_2h 后 5000-7000rpm 下離心20-30min 分相；透析除鹽的步驟為將下相溶液置于透析袋中進(jìn)行透析30_40h，換5-7次透析液。其中，步驟(7)為冷凍干燥制得藍(lán)色粉末狀的藻藍(lán)蛋白成品。所述的螺旋藻優(yōu)選為鈍頂螺旋藻。本專利技術(shù)的另一目的是提供由上述方法制備的藻藍(lán)蛋白粗提物。本專利技術(shù)的提取方法制得的藻藍(lán)蛋白粗提物可于4°C下保存30日不變性，可用于藻藍(lán)蛋白的貯存，使具有抗氧化活性及熒光特性的藻藍(lán)蛋白長時(shí)間貯存。本專利技術(shù)的另一目的是提供由上述方法制備的藻藍(lán)蛋白成品。本專利技術(shù)制得的藻藍(lán)蛋白粗提液2在紫外可見光譜下檢測(cè)的純度為A620/280=3. 5-3. 94。本專利技術(shù)制得的藻藍(lán)蛋白精提液在紫外可見光譜下檢測(cè)的純度為A620/280=5. 6-6. 2。本專利技術(shù)制得的藻藍(lán)蛋白成品，藻藍(lán)蛋白與螺旋藻藻粉的比得率為14. 59-16. 32mg/g°本專利技術(shù)所得藻藍(lán)蛋白提取物溶液相關(guān)抗氧化活性測(cè)定指標(biāo)有三點(diǎn)DPPH清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子清除率；所用方法分別為DPPH體系、Feton體系、鄰苯三酚自氧化體系。本專利技術(shù)所得藻藍(lán)蛋白提取物溶液相關(guān)熒光活性測(cè)定有兩點(diǎn)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)和熒光顯微鏡照片。本專利技術(shù)制得的藻藍(lán)蛋白能夠很好的保持藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性，對(duì)DPPH自由基、羥自由基(-0H)的清除率隨藻藍(lán)蛋白純度的增加而顯著增大，制得的藻藍(lán)蛋白成品的羥自由基半清除率IC5tl=O. 19lmg/mL，DPPH半清除率IC5tl=O. 296mg/mL ;熒光顯微鏡下其熒光強(qiáng)度與計(jì)量成比例關(guān)系，熒光分光光度計(jì)檢測(cè)650nm有最大熒光發(fā)射峰。本專利技術(shù)的螺旋藻藻藍(lán)蛋白及其貯存和提取方法具有的優(yōu)點(diǎn)(I)本專利技術(shù)依次采用硫酸銨分級(jí)鹽析、PEG20000-NaCl聚合物沉淀、雙水相萃取和透析除鹽，避免了傳統(tǒng)層析技術(shù)的成本高、收率低(〈1%藻藍(lán)蛋白/藻粉)等弊端，提取工藝簡單、成本低，適于間歇性和規(guī)模化生產(chǎn)加工高純度、高收率的螺旋藻藻藍(lán)蛋白成品。 (2)本專利技術(shù)制得的藻藍(lán)蛋白粗提物可于4°C下保存30日不變性，可用于藻藍(lán)蛋白的貯存，使具有抗氧化活性及熒光特性的藻藍(lán)蛋白長時(shí)間貯存。(3)本專利技術(shù)制得的藻藍(lán)蛋白成品純度高、具有良好的抗氧化自由基清除效果和熒光強(qiáng)度，將本專利技術(shù)不同步驟所得的藻藍(lán)蛋白樣品實(shí)施相關(guān)抗氧化活性和熒光活性測(cè)定，均未隨提取步驟的增加而明顯損失。附圖說明圖1是本專利技術(shù)的螺旋藻藻藍(lán)蛋白提取工藝流程圖；圖2是本專利技術(shù)實(shí)施例不同提取步驟中藻藍(lán)蛋白的收率、純度和外觀圖；其中，圖Ca)為不同提取步驟中藻藍(lán)蛋白的收率；圖(13)為不同提取步驟中藻藍(lán)蛋白的純度；圖((3)為不同提取步驟中藻藍(lán)蛋白的外觀圖，從左到右依次是細(xì)胞破碎液、藻藍(lán)蛋白粗提液1、藻監(jiān)蛋白粗提液2、操監(jiān)蛋白精提液；圖3是本專利技術(shù)實(shí)施例藻藍(lán)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：（1）制備螺旋藻粉懸濁液：取螺旋藻粉溶解于磷酸鹽緩沖液中，制得螺旋藻粉懸濁液；（2）制備螺旋藻細(xì)胞破碎液：將螺旋藻粉懸濁液采用反復(fù)凍融法結(jié)合機(jī)械破碎法處理，離心取上清，得到螺旋藻細(xì)胞破碎液；（3）制備藻藍(lán)蛋白粗提液1：采用30%和50%硫酸銨溶液分級(jí)鹽析沉淀螺旋藻細(xì)胞破碎液，透析除鹽，得到藻藍(lán)蛋白粗提液1；（4）制備藻藍(lán)蛋白粗提物：將PEG20000和NaCl溶解至藻藍(lán)蛋白粗提液1，配制成PEG20000?NaCl沉淀體系，靜置、離心取沉淀，得到藻藍(lán)蛋白粗提物。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉楊，虞永蕾，鐘名其，肖湘，趙永杰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：汕頭大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。