牛乳鐵蛋白肽及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及牛乳鐵蛋白肽及其制備方法，牛乳鐵蛋白肽(Bovine?Lactoferricin，簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)fcin?B)是經(jīng)胃蛋白酶從牛乳鐵蛋白(bLF)N-端(17～41)水解的25個(gè)氨基酸殘基，分子量約為3.1kd；其制備方法包括：1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建；2)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白；3)蛋白質(zhì)的分離與純化。本發(fā)明專利技術(shù)的有益效果為：Lfcin?B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳鐵蛋白400倍，能在胃腸道中發(fā)揮更重要的作用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及。
技術(shù)介紹
抗生素作為抗菌和促生長(zhǎng)添加劑在動(dòng)物飼料中使用已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史，但隨著人們認(rèn)識(shí)水平的提高，抗生素在動(dòng)物飼料中的廣泛使用暴露出越來越多的負(fù)面作用，其中最為嚴(yán)重的，一是能造成畜禽產(chǎn)品中的藥物殘留，直接影響消費(fèi)者的身體健康；二是嚴(yán)重影響動(dòng)物消化道的微生態(tài)平衡，造成一些病原菌耐藥性的發(fā)生，使得針對(duì)由這些病原菌所引起的感染的預(yù)防和治療變得非常困難。目前，細(xì)菌抗藥性問題普遍存在，而且耐藥菌株的數(shù)量也顯著增加，一些原來威脅人類生命的疾病，比如肺結(jié)核等，重又開始大范圍發(fā)生。丹麥?zhǔn)亲钤缃乖陲暳现惺褂每股氐膰遥瑥?994年開始，逐步減少抗生素在飼料中的使用。 2003年，世界衛(wèi)生組織(WHO)建議按照丹麥的模式逐步減少抗生素的使用。2006年，歐盟已經(jīng)全面禁止抗生素在動(dòng)物飼料中的使用。雖然我國還沒有立法阻止抗生素作為飼料添加劑的使用，也在逐步減少使用量。但是，目前我國仍有20余種抗生素在動(dòng)物飼料中使用。 隨著我國加入WT0，抗生素的使用已經(jīng)嚴(yán)重影響了我國畜牧業(yè)產(chǎn)品在國際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。 因此，開發(fā)新型抗生素替代品對(duì)我國畜牧業(yè)的安全、健康、和諧發(fā)展越來越重要。抗菌肽(antibacterial peptides)是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界病原微生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小分子多肽，它是動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。抗菌肽是由生物特定基因編碼，具有廣譜抗菌活性，尤其對(duì)耐藥菌株有明顯的殺滅作用，且不破壞生物體細(xì)胞，無免疫原性。抗菌肽可大致分為以下幾類殺菌肽類 (cecropins)、富含脯氨酸殘基的娃皮素(magainin)、富含甘氨酸的蜂毒素(melittin)、富含胱氨酸殘基的防御素(defensin)和富含脯氨酸和精氨酸的cathelicidin族抗菌肽類。 抗菌肽具有高效抗細(xì)菌、真菌、病毒，甚至抗腫瘤活性，在農(nóng)業(yè)和臨床治療上都有廣闊的應(yīng)用前景，是最具開發(fā)前景的抗生素替代品
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種牛乳鐵蛋白肽(Bovine Lactoferricin,簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)fcinB) 及其制備方法，Lfcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳鐵蛋白400倍，能在胃腸道中發(fā)揮更重要的作用。本專利技術(shù)的目的是通過以下技術(shù) 方案來實(shí)現(xiàn)牛乳鐵蛋白肽的核苷酸序列為GCTCCAAGAAAGAACGTTAGATGGTGTACTATTTCTCAACCAGAATGGTTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGCTTTGGAATGTATTAGAGCTATTGCTGAGAAGAAGGCTGATCCTGTTACTTTGGATGGTGGTATGGTTTTCGAAGCTGGTAGAGATCCATACAAGTTGAGACCAGTTGCTGCTGAAATTTACGGTACTAAGGAATCTCCACAAACTCATTACTACGCTGTTGCTGTTGTTAAGAAGGGTTCTAACTTTCAATTGGATCAATTGCAAGGTAGAAAGTCTTGTCATACTGGTTTGGGTAGATT其中牛乳鐵蛋白肽核苷酸序列的活性中心為TTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTC該牛乳鐵蛋白妝的氣基酸序列為aprknvrwctisqpewfkcrrwqwrmkklgapsitcvrrafaleciraiaggmvfeagrdpyklrpvaae iygtkespqt hyyavavvkk gsnfqldqlq grkschtglgr其中牛乳鐵蛋白肽氨基酸序列的活性部分為fkcrrwqwrm kklgapsitc vrraf。 該序列共由365個(gè)堿基組成，其中，5’端信號(hào)肽包括48個(gè)堿基，3’端融合蛋白部分包括240個(gè)堿基，活性中心由75個(gè)堿基(從第49位到第123位)組成，編碼具有序列表中的氨基酸序列的Bovine Lactoferricin蛋白，編碼區(qū)中，A占28.1 % (102個(gè))，C占 14. 3% (52個(gè))，6占26.2% (95 個(gè))，T 占 31. 4% (114 個(gè))，A+T 占 59. 5% (216 個(gè))，C+G 占 40. 5% (147 個(gè))。牛乳鐵蛋白肽的制備方法包括以下步驟1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1.1、牛乳鐵蛋白肽基因的合成；人工合成牛乳鐵蛋白的前I 121氨基酸序列。1. 2、牛乳鐵蛋白妝基因的克隆；人工合成一對(duì)引物，并在其5’端分別加上BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。上游引物及下游引物如下Blf-F 5/ ~TATCGGATCCGCTCCAAGAAAGAACGTT~3/，Blf-R 5/ ~GGTGCTCGAGTTATCTACCCAAACCAGTATG~3/。1. 3、構(gòu)建重組表達(dá)載體。2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白2.1、含牛乳鐵蛋白肽基因的工程菌的獲得；2. 2、誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。3、蛋白質(zhì)的分離與純化3.1、融合蛋白的分離；3. 2、融合蛋白的濃縮；3. 3、融合蛋白的純化；3. 4、牛乳鐵蛋白肽的保存。本專利技術(shù)的有益效果為1、在水溶液中呈親水脂的兩個(gè)反向β折疊結(jié)構(gòu)，具有耐熱、在消化道不易被降解、無抗原性的特征，能調(diào)節(jié)免疫作用，具有廣譜抗菌作用，不干擾腸道有益菌等特性；2、其對(duì)許多G+和G-均有抗菌作用，如大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等，但不作用于雙歧桿菌等對(duì)人體有益細(xì)菌、同時(shí)還能刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)、參與免疫調(diào)節(jié)；3、由于其特殊的功能作用，作為飼料添加劑以食品防腐劑的開發(fā)研究，已經(jīng)受到國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)和制造商的重視，成為研究熱點(diǎn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例基因工程生產(chǎn)牛乳鐵蛋白肽1、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1> Bovine Lactoferricin I 基因的合成人工合成牛乳鐵蛋白的前I 121氨基酸序列(下劃線部分為牛乳鐵蛋白肽(共 363bp，121個(gè)氨基酸)GCTCCAAGAAAGAACGTTAGATGGTGTACTATTTCTCAACCAGAATGGTTTAAGTGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAGAAGTTGGGTGCTCCATCTATTACTTGTGTTAGAAGAGCTTTCGCTTTGGAATGTATTAGAGCTATTGCTGAGAAGAAGGCT GATGCTGTTACTTTGGATGGTGGTATGGTTTT°C GAAGCTGGTAGAGATCCATACAAGTTGAGACCAGTTGCTGCTGAAATTTACGGTACTAAGGAATCTCCACAAACTCATTACTACGCTGTTGCTGTTGTTAAGAAGGGTTCTAACTTTCAATTGGATCAATTGCAAGGTAGAAAGTCTTGTCATACTGGTTTGGGTAGA TT保存于pUC19/T0P10 中。1. 2> Bovine Lactoferricin I 基因的克隆人工合成一對(duì)引物，并在其5’端分別加上BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。上游引物及下游引物如下Blf-F 5本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種牛乳鐵蛋白肽，其特征在于，該牛乳鐵蛋白肽的核苷酸序列為：GCT?CCA?AGA?AAG?AAC?GTT?AGA?TGG?TGT?ACT?ATT?TCT?CAA?CCA?GAATGG?TTT?AAG?TGT?AGA?AGA?TGG?CAA?TGG?AGA?ATG?AAG?AAG?TTG?GGTGCT?CCA?TCT?ATT?ACT?TGT?GTT?AGA?AGA?GCT?TTC?GCT?TTG?GAA?TGTATT?AGA?GCT?ATT?GCT?GAG?AAG?AAG?GCT?GAT?GCT?GTT?ACT?TTG?GATGGT?GGT?ATG?GTT?TTC?GAA?GCT?GGT?AGA?GAT?CCA?TAC?AAG?TTG?AGACCA?GTT?GCT?GCT?GAA?ATT?TAC?GGT?ACT?AAG?GAA?TCT?CCA?CAA?ACTCAT?TAC?TAC?GCT?GTT?GCT?GTT?GTT?AAG?AAG?GGT?TCT?AAC?TTT?CAATTG?GAT?CAA?TTG?CAA?GGT?AGA?AAG?TCT?TGT?CAT?ACT?GGT?TTG?GGTAGA?TT該牛乳鐵蛋白肽的氨基酸序列為：aprknvrwct?isqpewfkcr?rwqwrmkklg?apsitcvrra?faleciraia?ekkadavtld?ggmvfeagrdpyklrpvaae?iygtkespqt?hyyavavvkk?gsnfqldqlq?grkschtglgr。...

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：夏新界，李圣翔，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：廣州格拉姆生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：