本發明專利技術提供了一種制備抗凝血酶的方法，它包括如下步驟：a.沉淀溶解；b.PEG沉淀；c.病毒滅活；e.調制；h.殘留肝素吸附；i.病毒滅活；j.除菌分裝，凍干。本發明專利技術采用化學穩定性更好的硬性硅膠基質（HeparinHyperD）進行肝素親和層析，這種基質耐堿處理的能力更好，更適用于工業化生產的需要，發明專利技術人在純化技術及病毒滅活去除方面均進行改進，并加以進行有機組合，以期進行血漿深度綜合利用，提高AT-Ⅲ制劑的有效性及安全性，為臨床治療提供新的選擇。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及運用改良K-N法組份IV沉淀制備人抗凝血酶的方法，屬血漿蛋白領域。
技術介紹
人抗凝血酶(Human Antithrombin- III, AT-III)是體內重要抗凝物質，它是相當分子量為58KD的單鏈α 2糖蛋白，由432個氨基酸組成，內含3個二硫鍵和4個寡糖側鏈，多糖含量約15%。在機體內分布于腎臟，肺臟，特別是肝臟血管內皮細胞，AT-III正常血漿水平為80-300mg/L，其活性70%_130%。AT- III與絲氨酸蛋白酶作用的活性位點位于八找393-5虹394處，蛋白酶攻擊該鍵使其裂解并引起41'-111變構，從而形成41'-111與酶I :I復合物，這種共價結合是不可逆的，能被肝素或硫酸乙酰肝素大大加強。AT-III與其他絲氨酸蛋白酶抑制劑如α 2-抗溶纖酶(α 2-ΑΡ)，肝素輔因子(HC- II)和纖溶酶原激活抑制物(PAI)等在氨基酸序列機構上具有同源性。AT-III抑酶很廣，除凝血酶以外，對凝血因子II a, Xa, IXa, XIa, XDa以及纖溶酶，胰蛋白酶，激肽釋放酶和補體均有滅活作用。AT-III的臨床適應癥為1.遺傳性AT-III缺陷癥；2.預防深靜脈血栓和動脈血栓；3.彌散性血管內凝血(DIC);4.肝硬化和重癥肝炎；5.血液透析和腎病綜合癥；6.骨髓移植和化療藥物繼發的AT- III缺陷。在抗凝血酶III凍干品制備相關研究方面，曹海軍等人抗凝血酶III凍干保護劑的初步篩選，中國輸血雜志，2010年第23卷增刊第5頁報道了人抗凝血酶III凍干保護劑的初步篩選。作者的結論稱初步確定人抗凝血酶III凍干保護劑為1%丙氨酸+1%蔗糖。孫國山等抗凝血酶III的制備及對小鼠血栓形成的防治效果觀察，河北中西醫結合雜志，1996. 07. 05; 5 (3) 6-7，報道了抗凝血酶III的制備及對小鼠血栓形成的防治效果觀察研究中，作者報道以枸櫞酸鈉血漿為原料，用肝素瓊脂糖凝膠吸附后經洗滌粗提，再經肝素瓊脂糖凝膠親和層析步驟純化，最后經透析、病毒滅活及凍干保存制備抗凝血酶III制劑的研究。在上述制備過程中，作者采用的病毒滅活方法為對粗提液進行60°c IOh加熱。張榮軍等利凡諾去白蛋白人血漿再利用的實驗研究II .抗凝血酶III和蛋白C抑制物的純化與鑒定，中國生化藥物雜志，2001. 08. 15; 22 (4) 172-174，報道了綜合再利用利凡諾去白蛋白人血漿 進行抗凝血成分抗凝血酶III (AT-III)和蛋白C抑制物(PCI)的分離純化。其方法為，以鋇鹽吸附上清為原料，采用鋁鹽吸附、有機沉淀、離子交換層析、分子篩層析、親和層析和制備性等電聚焦等技術從利凡諾去白蛋白人血漿中分別純化AT-III和PCI。結果顯示，從利凡諾去白蛋白人血漿IOL中得到了 AT- III 160mg，得率為12. 7%，最后制品均凍干保存。作者的結論認為，其采用的純化路線經濟、簡便，有助于利凡諾去白蛋白人血漿的綜合再利用和抗凝血成分輸血制劑的研制和開發。劉文方抗凝血酶III濃縮物制備及臨床應用的研究I :抗凝血酶III的分離與純化，中國輸血雜志1988; (3) 105-108，報道的抗凝血酶III濃縮物制備及臨床應用的研究I :抗凝血酶III的分離與純化研究中，作者采用肝素-Sepharose4B凝膠批量親和吸附法從血漿中分離、純化出抗凝血酶III。其中采用的病毒滅活工藝也為對AT-III液進行601 1Oh加熱。加熱后于冷室中透析，然后進行過濾、分裝、冰凍干燥保存。另外，梁一平等人抗凝血酶III的分離提純，軍隊醫藥1999. 09. 20; 9 (3) 56-58，報道了人抗凝血酶III的分離提純研究。通過低溫乙醇處理血漿，得到的沉淀經肝素-瓊脂糖兩次親和吸附，并透析、濃縮。其中的病毒滅活過程也采用巴氏消毒法進行。用此方法提純的AT -III經聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳分析，顯示所提取的AT -III為單一成分，等電點為5.2，從血漿開始計算的AT -III回收率為8.5%。霍夫曼等Hoffman et al Purification and large-scale preparation of antithrombin III. AmJ Med. 1989 Sep11；87(3B) :23S-26S.則報道了抗凝血酶III的大規模提純和制備。作者稱Cutter公司從Cohn F IV-I組份進行了大規模抗凝血酶III的提純與制備。初始材料經采用肝素親和層析法分離出抗凝血酶III濃縮液后用巴氏滅菌法消毒去除乙肝及獲得性免疫缺陷綜合征病毒。加熱后再次用肝素親和層析法分離出具備活性的抗凝血酶III并去除熱變性蛋白；最后制備成凍干制劑。萊賓等 Lebing et al A highly purified anti thrombin IIIconcentrate preparedfrom human plasma fraction IV-I by affinity chromatography.Vox Sang. 1994; 67 (2) : 117-24.采用Cohn F IV _1組份經過第一次肝素親和層析純化后進行巴氏加熱進行病毒滅活，再進行第二次肝素親和層析純化以去除變性的AT- III得到高純制齊U，但此工藝僅采用一步巴氏病毒，制品安全性是不夠的。比斯科斯等Biescas et al Characterization and viral safety validation study of apasteurized therapeuticconcentrate of antithrombin III obtained through affinitychromatography.Haematologica. 1998 Apr; 83⑷:305-11.對采用親和層析法獲得的抗凝血酶III濃縮物進行巴氏病毒滅活的安全性驗證研究。另外，海斯密斯等Highsmith et al Iodine-mediated inactivation of I ipid-andnonlipid-enveloped viruses in humananti thrombin III concentrate. Blood. 1995Jul 15; 86 (2) : 791-6.報道了抗凝血酶 III 濃縮物加入碘液進行病毒滅活的研究。作者發現加碘會使抗凝血酶III失去活性，而再加入人血蛋白則可使抗凝血酶III免于加碘導致的失活。奧等Oh et al Evaluation of thevirus-eliminationefficacy of nanofiltration(Viresolve NFP)for the parvovirusB19 and hepatitis Avirus. Korean J Lab Med. 2010 Feb; 30 (I) : 45-50.報道了米用納米過濾的方法去除抗凝血酶III中的B19和甲肝病毒的研究。在國外專利方面，塔納卡等TANAKA et al PURIFICATION OFANTITHROMBI N-IIIJP 10168100 Publi本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種制備抗凝血酶的方法，其特征在于：它包括如下步驟：a.沉淀溶解：取改良K?N法組份Ⅳ沉淀溶解于8?12倍體積的pH8.1?9.0的緩沖液中，常溫分散混懸攪拌1小時，30?40℃加熱攪拌1小時，再常溫攪拌4?14小時，得溶解液；b.PEG沉淀：將a步驟溶解液冷至5℃，加入PEG3000?6000至濃度為6?12%（g/ml），攪拌1小時，用酸調整pH值至5.95?6.05，加入1.0?2.0%助濾劑，攪拌過濾得到PEG上清液，上清液用堿調到pH7.35?7.45；c、病毒滅活：S/D法；d、純化：采用肝素親和層析純化；e、調制；f、純化：采用肝素親和層析純化；g.超濾透析；h.殘留肝素吸附；i.病毒滅活：15nm納米過濾；j.除菌分裝,凍干。
【技術特征摘要】
1. 一種制備抗凝血酶的方法，其特征在于它包括如下步驟 a.沉淀溶解取改良K-N法組份IV沉淀溶解于8-12倍體積的pH8.1-9. O的緩沖液中，常溫分散混懸攪拌I小時，30-40°C加熱攪拌I小時，再常溫攪拌4-14小時，得溶解液； b.PEG沉淀將a步驟溶解液冷至5°C，加入PEG3000-6000至濃度為6-12% (g/ml)，攪拌I小時，用酸調整pH值至5. 95-6. 05，加入I. 0-2. 0%助濾劑，攪拌過濾得到PEG上清液，上清液用堿調到PH7. 35-7. 45 ； C、病毒滅活S/D法； d、純化采用肝素親和層析純化； e、調制； f、純化采用肝素親和層析純化； g.超濾透析； h.殘留肝素吸附； i.病毒滅活:15nm納米過濾； j.除菌分裝，凍干。2.一種制備抗凝血酶的方法，其特征在于它包括如下步驟 a.沉淀溶解取改良K-N法組份IV沉淀溶解于8-12倍體積的pH8.1-9. 0的緩沖液中，常溫分散混懸攪拌I小時，30-40°C加熱攪拌I小時，再常溫攪拌4-14小時，得溶解液，棄去沉淀，在上清液中加入2-3%助濾劑，邊攪拌邊進行壓濾得濾液，超濾濃縮至濾液體積的1/6-1/7，濃縮液蛋白濃度控制在5. 1_6%，得超濾濃縮液； b.PEG沉淀將a步驟超濾濃縮液冷至5°C，加入PEG3000-6000濃度為6-12% (g/ml),攪拌I小時，用酸調整pH值至5. 95-6. 05，加入I. 0-2. 0%助濾劑，攪拌過濾得到PEG上清液，上清液用堿調到PH7. 35-7. 45 ； C、病毒滅活S/D法； d、純化采用肝素親和層析純化； e、調制； f、純化采用肝素親和層析純化； g.超濾透析； h.殘留肝素吸附...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳強，蔡駿，廖穎，初毅波，胡曉東，
申請(專利權)人：成都蓉生藥業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。