一種制備穩定的白蛋白納米顆粒的方法技術

一種制備穩定的白蛋白納米顆粒的方法，屬于生物醫藥材料制備技術領域。該方法利用無生物毒性的谷胱甘肽或半胱氨酸對白蛋白進行預處理，打開分子內二硫鍵，采用醇類等反溶劑沉淀白蛋白，利用巰基-二硫鍵交換反應得到分子間二硫鍵的白蛋白納米顆粒。利用所制備的納米粒可以用于體內遞送藥理活性物質和/或診斷助劑。本發明專利技術所得到的白蛋白納米顆粒的優點在于不但在稀釋條件下具有良好的穩定性，同時也在還原型環境中具有氧化還原響應。這種特性使得該顆粒可以穩定存在于生物體內血液循環系統中，并在細胞中在還原型谷胱甘肽的作用下降解并釋放出所包裹的藥物。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種白蛋白納米顆粒的制備方法，屬于生物醫藥材料制備

技術介紹
白蛋白是一種生物內源性蛋白，具有的可生物降解、無毒、無抗原性等諸多特點，被認為是一個理想的藥物載體，白蛋白載藥體系是現今藥學研究中一個極具生命力的研究方向。白蛋白載藥體系主要分為兩大類，一類是化學偶聯的白蛋白載藥體系，另一類是物理結合的白蛋白載藥體系。化學偶聯的白蛋白可以改善藥物的藥代動力學特性，但結合后形成了新的化學分子。物理結合形式的白蛋白給藥體系是一個更為理想的載藥模式，將藥物分子包裹在白蛋白納米顆粒中，可以明顯提高非水溶性藥物在水溶液中 (即體內血液循環系統中)的穩定性與溶解度。同時，利用腫瘤組織的透過性增強及滯留效應(EPR effect),可以使得白蛋白納米載藥體系達到靶向給藥的目的。由于白蛋白分子具有極好的水溶性，如何使得白蛋白納米顆粒在水中有著良好的穩定性，在稀釋條件下不溶解是目前制備技術上的難點。戊二醛等交聯劑常被用來穩定得到的納米顆粒，但是戊二醛會非選擇性的結合白蛋白表面的氨基位點，在生物體內會釋放出醛類殘基，對生物體有著顯著毒副作用。有報道一種自組裝的白蛋白納米粒合成技術(CNIO 2 O4869 5A )，利用巰基乙醇等作為還原劑打開了白蛋白分子的二硫鍵，使其利用疏水相互作用結合成為納米顆粒，但該顆粒在10%乙醇水溶液中即全部溶解，說明該顆粒僅靠疏水相互作用穩定，而并非二硫鍵結合穩定(Gong M. G. et al. , Biomacromolecules, 2012，13，23-28)。American Bioscience公司開發了一種基于二硫鍵形成的nab技術(Nanoparticle albumin-bound technology),以白蛋白作為基質和穩定劑，在不加入任何乳化劑和交聯劑的情況下制得到白蛋白納米粒(US6753006B1)。但近年來在對Abraxane產品稀釋實驗(Chauhan V. P. et al. , Nature Nanotech·，2012，7，383-388.表明，Abraxane稀釋到緩沖溶液或者牛血清白蛋白溶液中后，會立刻分解成為IOnm左右的大小的顆粒，這表明該產品也并非由二硫鍵交聯而得。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供，該白蛋白納米粒由分子間二硫鍵交聯而穩定，用以解決某些藥理活性物質難以進行體內遞送的問題。為了實現本專利技術的目的，本專利技術的技術方案為，如下步驟進行I)制備體積質量濃度為10 200mg/mL的白蛋白水溶液；2)在白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽或半胱氨酸，使其在白蛋白水溶液中的摩爾濃度達到10 500mM，在溫度10 60°C下反應5 180min ；3)在步驟2)反應后的溶液中加入乙醇或叔丁醇，在溫度10 60°C下，反應5 120min，得到分子間二硫鍵交聯的白蛋白納米顆粒的懸濁液；所述的白蛋白水溶液與加入的乙醇或叔丁醇的體積比為1:1 5 ;4)將白蛋白納米顆粒的懸濁液在溫度O 20°C下透析，得到白蛋白納米顆粒溶液，再經過冷凍干燥、噴霧干燥或減壓蒸餾進行脫水處理，得到白蛋白納米顆粒。一種用于遞送體內藥理活性藥物的白蛋白納米顆粒的制備方法，按如下步驟進行I)制備體積質量濃度為10 200mg/mL的白蛋白水溶液；2 )在白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽或半胱氨酸，使其在白蛋白水溶液中的摩爾濃度達到10 500mM，在溫度10 60°C下反應5 180min ；3)在步驟2)反應后的溶液中加入藥理活性藥物的乙醇溶液或藥理活性藥物的叔丁醇溶液，在溫度10 60°C下反應5 120min,得到包裹藥理活性物質的白蛋白納米顆粒的懸濁液；所述的白蛋白水溶液與加入的藥理活性藥物的乙醇溶液或藥理活性藥物的叔丁醇溶液的體積比為1:1 5 ;4)將白蛋白納米顆粒的懸濁液在溫度O 20°C下透析，得到包裹藥理活性物質的白蛋白納米顆粒的溶液，再經過冷凍干燥、噴霧干燥或減壓蒸餾進行脫水處理，得到包裹藥理活性物質的白蛋白納米顆粒。本專利技術技術方案中得到的白蛋白納米粒平均粒徑為10 500nm。本專利技術技術方案中所述的白蛋白分子包括人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),重組人血清白蛋白(recombinant HSA,rHSA)，或它們的組合。本專利技術技術方案中所述的包裹藥理活性物質的白蛋白納米顆粒中可包載占納米粒總總量1°/Γ90%的藥理活性物質。本專利技術技術方案中所述的藥理活性物質為抗癌藥物。本專利技術技術方案中所述的抗癌藥物包括紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、姜黃素、鉬及其類似物、甲氨蝶呤或它們的組合。 本專利技術所制得的白蛋白納米顆粒和包裹藥理活性物質的白蛋白納米顆粒的優點在于納米顆粒中的白蛋白有分子間二硫鍵交聯，在PH范圍3-4以及6-10之間的水溶液中均穩定存在，在體積分數為I 50%的乙醇水溶液中穩定存在，并在生理條件(37°C，pH=7. 4)下的稀釋實驗中穩定存在，同時該顆粒可以在還原性環境中能夠逐步溶解。以上特性使得該顆粒可以穩定存在于生物體內血液循環系統中，并在細胞中在還原型谷胱甘肽的作用下降解并釋放出所包裹的藥物。附圖說明圖1為本專利技術中白蛋白納米粒在不同溶劑環境中的穩定性研究。圖2為本專利技術中白蛋白納米粒在還原型條件下逐步溶解后的SDS-PAGE電泳圖。其中，I為白蛋白納米粒的條帶，2為白蛋白低聚物的條帶，3為白蛋白二聚體和三聚體的條帶，4為白蛋白單分子的條帶。圖3為本專利技術中白蛋白-姜黃素納米粒的掃面電子顯微鏡圖像和透射電子顯微鏡圖像。其中，A和B為掃面電子顯微鏡圖像，C和D為透射電子顯微鏡圖像。具體實施例方式本專利技術提供的，該方法按如下步驟進行I)制備體積質量濃度為10 200mg/mL的白蛋白水溶液；所述的白蛋白一般采用人血清白蛋白、牛血清白蛋白、重組人血清白蛋白或它們的組合。2)在白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽或半胱氨酸，使其在白蛋白水溶液中的摩爾濃度達到10 500mM，在溫度10 60°C下反應5 180min ；3)在步驟2)反應后的溶液中加入乙醇或叔丁醇，在溫度10 60°C下反應5 120min，得到分子間二硫鍵交聯的白蛋白納米顆粒的懸濁液；所述的白蛋白水溶液與加入的乙醇或叔丁醇的體積比為1:1 5 ;4)將白蛋白納米顆粒的懸濁液在溫度O 20°C下透析，得到白蛋白納米顆粒溶液，再經過冷凍干燥、噴霧干燥或減壓蒸餾進行脫水處理，得到白蛋白納米顆粒。得到的白蛋白納米粒平均粒徑為10 500nm。本專利技術提供的一種用于遞送體內藥理活性藥物的白蛋白納米顆粒的制備方法，該方法按如下步驟進行 I)制備體積質量濃度為10 200mg/mL的白蛋白水溶液；2)在白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽或半胱氨酸，使其在白蛋白水溶液中的摩爾濃度達到10 500mM，在溫度10 60°C下反應5 180min ；3)在步驟2)反應后的溶液中加入藥理活性藥物的乙醇溶液或活性藥物的叔丁醇溶液，在溫度10 60°C下反應5 120min,得到包裹藥理活性物質的白蛋白納米顆粒的懸濁液；所述的白蛋白水溶液與加入的藥理活性藥物的乙醇溶液或藥理活性藥物的叔丁醇溶液的體積比為1:1 5 ;藥理活性物質為抗癌本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備穩定的白蛋白納米顆粒的方法，其特征在于該方法按如下步驟進行：1）制備體積質量濃度為10～200mg/mL的白蛋白水溶液；2）在白蛋白水溶液中加入谷胱甘肽或半胱氨酸，使其在白蛋白水溶液中的摩爾濃度達到10～500mM，在溫度10～60℃下反應5～180min；3）在步驟2）反應后的溶液中加入乙醇或叔丁醇，在溫度10～60℃下反應5～120min，得到分子間二硫鍵交聯的白蛋白納米顆粒的懸濁液；所述的白蛋白水溶液與加入的乙醇或叔丁醇的體積比為1：1～5；4）將白蛋白納米顆粒的懸濁液在溫度0～20℃下透析，得到白蛋白納米顆粒溶液，再經過冷凍干燥、噴霧干燥或減壓蒸餾進行脫水處理，得到白蛋白納米顆粒。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：王文坦，黃延賓，程易，
申請(專利權)人：清華大學，
類型：發明
國別省市：