本發(fā)明專利技術(shù)涉及miR-146a作為調(diào)節(jié)血管生長靶標(biāo)的用途。首次公開了miR-146a在血管生長中發(fā)揮作用，其通過上調(diào)VEGF而促進(jìn)血管的生長。因此，miR-146a抑制劑可用于抑制血管生長，從而預(yù)防、緩解或治療血管過度生長相關(guān)的疾病，如關(guān)節(jié)炎；而miR-146a促進(jìn)劑可用于促進(jìn)血管生長，從而用于需要促進(jìn)血管生長的疾病狀態(tài)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物
；更具體地，本專利技術(shù)涉及miR-146a作為調(diào)節(jié)血管生長靶標(biāo)的用途。
技術(shù)介紹
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種促 進(jìn)血管生長的因子，其表達(dá)上調(diào)代表著血管生長的促進(jìn)；反之則血管生長緩慢。血管生長的失調(diào)與許多疾病相關(guān)，計(jì)入關(guān)節(jié)炎、腫瘤等。關(guān)節(jié)炎是常見的慢性疾病，由炎癥、感染、創(chuàng)傷或其他因素引起的關(guān)節(jié)炎性病變，常見的是骨關(guān)節(jié)炎(OA)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)，我國關(guān)節(jié)炎患者估計(jì)有I億以上，且人數(shù)在不斷增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國50歲以上人群中半數(shù)患骨關(guān)節(jié)炎；65歲以上人群中90%女性和80%男性患骨關(guān)節(jié)炎。關(guān)節(jié)炎主要病理改變包括軟骨退行性破壞，滑膜增生等。在關(guān)節(jié)炎中許多細(xì)胞因子參與這一過程，而IL-1 β是主要的分解代謝因子，IL-1 β上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加重了軟骨的破壞。近年來發(fā)展了多種藥物和療法來減輕主要由關(guān)節(jié)炎的炎癥引發(fā)的疼痛，但是對于治愈受累部位的軟骨破壞卻無計(jì)可施。在過去的幾十年中，miRNA作為動物和植物中一類新的基因調(diào)控分子越來越受到矚目，超過三分之一的人類基因受到miRNA調(diào)節(jié)。Stanczyk等報(bào)道在RA滑膜中，miR-146表達(dá)上調(diào)。 Nakasa 等 艮道在來源于RA病人的滑膜組織中，miR-146a/b表達(dá)上升 0 已有研究表明miR-146a在人類關(guān)節(jié)軟骨的所有層面表達(dá)，尤其是在軟骨表層o目前，miR_146a與血管生長、關(guān)節(jié)炎等的關(guān)系以及具體的作用靶點(diǎn)還屬未知。在藥物開發(fā)過程中，藥物靶點(diǎn)的研究是至關(guān)重要的。因此，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)一步研究miR-146a在調(diào)節(jié)血管生長過程中的作用機(jī)制和靶點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供miR_146a作為調(diào)節(jié)血管生長靶標(biāo)的用途。在本專利技術(shù)的第一方面,提供一種miR_146a調(diào)節(jié)劑(調(diào)節(jié)miR_146a的表達(dá)水平的試劑)的用途，用于制備調(diào)節(jié)血管生長的組合物。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的血管生長是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的血管生長。在另一優(yōu)選例中，所述的miR_146a調(diào)節(jié)劑是miR_146a抑制劑,用于制備抑制血管生長的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于促進(jìn)Smad4基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白的表達(dá)；抑制血管內(nèi)皮生長因子的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)；或抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。在另一優(yōu)選例中，所述的血管是骨，軟骨，滑膜中的血管。在另一優(yōu)選例中，所述的miR_146a抑制劑包括(但不限于)化學(xué)合成的miRNA-146a抑制劑；以表達(dá)質(zhì)粒為載體的抑制miRNA_146a的病毒和非病毒產(chǎn)品；與miR-146a互補(bǔ)的核酸序列或序列片段。在另一優(yōu)選例中，所述的miR_146a 抑制劑是miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors。在另一優(yōu)選例中，所述的miR_146a調(diào)節(jié)劑是miR_146a促進(jìn)劑,用于制備增加血管內(nèi)皮生長因子的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物促進(jìn)血管生長、促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育、促進(jìn)損傷組織愈合、防治心血管疾病。在另一優(yōu)選例中，所述的miR_146a促進(jìn)劑是表達(dá)miR_146a的表達(dá)載體、病毒、化學(xué)合成的小分子化合物等。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)miR_146a的表達(dá)載體中，包含有miR_146a的表達(dá)盒。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)miR_146a的表達(dá)載體中，包含有miR_146a前體的表達(dá)盒。在本專利技術(shù)的另一方面，提供一種調(diào)節(jié)血管生長的方法，包括調(diào)節(jié)動物中miR_146a的表達(dá)。在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)血管生長是抑制血管生長；所述的方法包括給予動物有效量的miR-146a抑制劑。本專利技術(shù)的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。附圖說明圖UIL-Ιβ促進(jìn)miR_146a和VEGF的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Smad4。原代大鼠軟骨細(xì)胞在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用白介素處理。miR-146a、Smad4和VEGF的表達(dá)水平用實(shí)時(shí)定量PCR和Western檢測。A, miR-146a表達(dá)在24h內(nèi)逐漸增加。B, IL-1 β刺激后Smad4的mRNA水平下降。C，IL-1 β上調(diào)VEGF水平。數(shù)值為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土標(biāo)準(zhǔn)差。D，Smad4和VEGF的蛋白水平在IL-1 β刺激下分別下調(diào)和上調(diào)。條帶底部數(shù)值表示蛋白以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)的相對表達(dá)水平。圖2、Smad4是miR_146a的直接靶基因。A，圖示Smad4的3’ UTR與miR_146a的結(jié)合位點(diǎn)，上行序列為Smad4野生型序列(Smad-WT),中行序列為miR_146a序列，下行序列為Smad4突變型序列(Smad-MT)。B,miR-146a抑制Smad4 3’UTR的熒光素酶活性。HEK293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染含Smad43’ UTR或相應(yīng)突變3’ UTR的片段。過表達(dá)miR-146a導(dǎo)致野生型(WT) 3’ UTR熒光素酶活性降低，而突變后(MT)熒光素酶活性不受影響。數(shù)值為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土標(biāo)準(zhǔn)差。Vector為空質(zhì)粒對照。 C，過表達(dá)miR_146a抑制Smad4的表達(dá)，增加VEGF的表達(dá)。NC表示陰性對照，即轉(zhuǎn)染了陰性對照(轉(zhuǎn)染的對照RNA，序列為sense :5’_UUC UCC GAA CGU⑶C ACG UTT-3’，ant1-sense :5’ -ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’ )的軟骨細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)情況。D,下調(diào)miR_146a的表達(dá)導(dǎo)致Smad4上調(diào)和VEGF下調(diào)。條帶底部數(shù)值表示蛋白以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)的相對表達(dá)水平。其中Inhibitors NC表示抑制劑的陰性對照miRIDIANmicroRNA Hairpin Inhibitor Negative Control (購自 Dharmacon) ;miR_146a 抑制劑指miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitors (購自 Dharmacon)。圖3、抑制miR-146a削弱IL-1 β弓丨起的Smad4下調(diào)和VEGF上調(diào)。用miR_146a抑制劑轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，然后用IL-1 β處理24h。A,miR_146a抑制劑能夠顯著降低IL-1 β引起的miR_146a升高。其中，InhibitorsNC 表不抑制劑的陰性對照 miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor Negative Control。B, miR-146a抑制劑能夠拮抗IL_1 β對Smad4的抑制作用。C，由IL-1 β弓丨起的VEGF上調(diào)可被miR_146a抑制劑削弱。數(shù)值為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土標(biāo)準(zhǔn)差。D，蛋白水平，miR_146a抑制劑拮抗IL-1 β弓丨起的Smad4下調(diào)和VEGF上調(diào)。條帶底部數(shù)值表示蛋白以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)的相對表達(dá)水平。圖4、VEGF受Smad4調(diào)控。利用RNAi的方法降低Smad4的表達(dá)上調(diào)VEGF的蛋白水平。軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染Smad4的siRNA。 A,針對Smad4的siRNA有效降低Smad4的RNA水平。數(shù)值為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值土標(biāo)準(zhǔn)差。B，抑制Smad4增加VEGF的蛋白表達(dá)。其中siRNA ctrl表示無關(guān)序列對照。C，共轉(zhuǎn)miR_146a和Smad4的表達(dá)質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)miR_146a導(dǎo)致的VEGF上調(diào)。條帶底部數(shù)值表示蛋白以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)的相對表達(dá)水平。其中，Contr本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種miR?146a調(diào)節(jié)劑的用途，用于制備調(diào)節(jié)血管生長的組合物。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張曉玲，李晶，戴尅戎，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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