一種HIV-1耐藥野生型基因合成方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種HIV-1耐藥野生型基因合成方法,將長目的片段分段合成，并合成錯位互補片段，通過運用多次PCR方法合成所需目的基因片段，這一方法既簡單又安全，無需復(fù)雜的設(shè)備，也不需要一個高度管制的實驗環(huán)境，尤其適用感染性疾病目的基因的研究。本發(fā)明專利技術(shù)的技術(shù)方案在功能基因組學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，比如，在突變，缺失或嵌合基因編碼一個特定的蛋白質(zhì)，具有很大的靈活性。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種HIV-1耐藥野生型基因合成方法
本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)
，具體涉及一種Hiv-I耐藥野生型基因合成方法及引物。
技術(shù)介紹
基因合成是指在體外人工合成雙鏈DNA分子的技術(shù)，與寡核苷酸合成有所不同 寡核苷酸是單鏈的，所能合成的最長片段僅為IOOnt左右，而基因合成則為雙鏈DNA分子合成，所能合成的長度范圍50bp-12 kb。基因合成是用人工方法合成基因的技術(shù)，是基因獲取的手段之一，相對于從已有生物中獲取基因來說，基因合成無需模板，因而不受基因來源限制。人類首條人工合成的基因出現(xiàn)在上世紀60年代基因合成是當(dāng)前合成生物學(xué)的主要內(nèi)容，通過基因合成，可以獲得自然界中不存在的基因，為人類改造生物開辟了一個全新的方向，在可預(yù)計的將來，基因合成將在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用，在新能源、新材料、人工生命、核酸疫苗、生物醫(yī)藥[I] 等領(lǐng)域的作用已初步體現(xiàn)。基因合成也存在潛在的被開發(fā)成生物武器的可能，而這個可能性在幾個病毒的人工合成之后變得更加突出。目前基因合成有兩種途徑，一是向基因合成公司訂制，二是作本地基因合成。由于基因合成技術(shù)還沒有一個統(tǒng)一的方法，基因合成的技能和經(jīng)驗在合成過程中具有決定性的影響，所以大部分基因合成都是在專業(yè)人員手中完成的，這也決定了途徑一是目前的主要渠道。本地基因合成一般需要參考學(xué)術(shù)文章，這方面的文章有很多，如Neves F0, Ho PLj Raw I， Pereira CA， Moreira C， Nascimento AL Overexpression of a synthetic gene encoding human alpha interferon in Escherichia coli. Protein Expr Purif. Jun;35(2) :353-9(2004)。但大多只是個別基因的合成，只具備有限的參考價值，除非是那些為了研究技術(shù)本身而作的基因合成。HIV-I因其為RNA病毒，具有高突變特性。HIV病毒基因突變使藥物作用靶點結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致病毒對藥物不敏感或敏感性下降。因各種類型HIV耐藥相關(guān)的基因突變不斷發(fā)生，因此如何準確測定耐藥基因尤為重要。而一般的分子實驗室因條件及級別的限定，都是不能直接做艾滋病毒的實驗，換而言之，就無法直接從艾滋病毒中獲得藥物作用的靶點基因，只能通過實驗室人工合成耐藥突變模板，進行下一步的實驗。大部分的實驗室主要是通過公司來合成較長的目的片段，因此，需要一種可以在實驗室方法來合成想要的片段。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的第一方面的問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中HIV-I耐藥野生型基因合成困難的問題，提供一種步驟簡單、快速、準確、成本低的HIV-I耐藥野生型基因合成方法及引物。為了解決上述的第一方面的技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供的技術(shù)方案為一種HIV-I耐藥野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步驟(1)把HIV-I耐藥野生型基因，分成若干N段(n=20-40)的A堿基片段，即Al，A2， A3，A4，A5…An,并進行人工合成；設(shè)計并人工合成與上述片段互補的N-I堿基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn-I ;其中，任一 Bn堿基片段的5’端比各耐藥野生型基因片段的An堿基片段5’端后移20_25bp ;Bn堿基片段的端延伸到耐藥野生型基因片段的An+1堿基片段5’端20-25bp ；根據(jù)上述相互匹配的兩兩對應(yīng)互補片段設(shè)計并合成正向、反向引物；(2)將上述相互對應(yīng)部分互補的堿基片段分別進行PCR擴增，即Al/Bl，A2/B2,A3/ B3……An/Bn，使部分互補經(jīng)PCR擴增后變?yōu)橥耆パa；(3)再將上述具有互補片段的相鄰擴增產(chǎn)物，二次擴增；(4)以3個A堿基片段為單位分別合成167bp片段，并需要進行瓊脂糖凝膠的割膠回收純化，標記為Cl，C2, C4，C5…Cn/3，最后一個An片段可與Cn/3連接；(5)再運用PCR分別兩兩擴增Cl和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和ClO各可得到 309bp 片段，標記為 Dl, D2，D3，D4，D5 ；(6)再運用PCR分別兩兩擴增Dl和D2，D3和D4可得598bp片段，標記為E1，E2，D5跟 E2連接可得F1887bp ；(7)最后將El和Fl進行PCR連接就可以得到1508bp的片段；(8)將片段插入TA載體中，并鑒定野生型模板是否構(gòu)建正確。優(yōu)選地，所述步驟(I)中，把Hiv-I耐藥野生型基因分成31段并進行人工合成，每段含有44-49個堿基，如Seq No. I 31所示；設(shè)計并人工合成與HIV-I耐藥野生型基因互補的堿基片段30段，每段含40個堿基， 如Seq No. 32 61所示；根據(jù)上述相互匹配的兩兩對應(yīng)互補片段設(shè)計并合成正向、反向引物，如Seq No. 62 101所示。本專利技術(shù)中，HIV-I耐藥野生型基因序列來自GenBank，protein_id=〃AAC82598. 2〃 ；把 HIV-I耐藥野生型基因分成31段，每段含有44-49個堿基，如Seq No. I 31所示，即堿基序列標號I 31所示的片段。本專利技術(shù)中，序列Seq No. 62 91，即堿基序列標號2_1 2_30所示的片段是分別與序列Seq No. 32 61,即堿基序列標號1_1 1_30的片段對應(yīng)的引物。本專利技術(shù)中，序列Seq No. 92 101,即喊基序列標號62、62-4、62-7、62-10、 62-13、62-16、62-19、62-22、62-25、62-28是大量擴增各個3個片段為單位的正向引物。本專利技術(shù)將長目的片段分段合成，并合成錯位互補片段，通過運用多次PCR方法合成所需目的基因片段，這一方法既簡單又安全，無需復(fù)雜的設(shè)備，也不需要一個高度管制的實驗環(huán)境，尤其適用感染性疾病目的基因的研究。本專利技術(shù)的技術(shù)方案在功能基因組學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，比如，在突變，缺失或嵌合基因編碼一個特定的蛋白質(zhì)，具有很大的靈活性。本專利技術(shù)提供的方法可以穩(wěn)定合成IKB左右的片段。其優(yōu)點有⑴合成周期短，可以保證序列的100%正確無誤；⑵具有很大的靈活性，可以對基因的酶切位點和基因序列進行修改，方便下游的克隆和實驗；⑶研究人員根據(jù)自己的意愿設(shè)計得到自然界中很難獲得甚至不存在的基因。附圖說明圖I為本專利技術(shù)的Hiv-I耐藥野生型基因合成方法示意圖。圖2為Al和A2連接成功的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為Al，A2和A3連接成功的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4A為野生型模板片段跟TA載體連接后的質(zhì)粒，目的片段電泳圖；其中廣4為野生型質(zhì)粒電泳圖，6-10為引物擴增電泳圖；圖4B為野生型模板片段跟TA載體連接后的質(zhì)粒酶切電泳圖。圖5為耐藥突變點M41L (ATG-CTG)野生型測序圖與突變型測序圖之間的比較，進一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。圖6為耐藥突變點K65R ( AAA-AGA)野生型測序圖與突變型測序圖之間的比較， 進一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。圖7為耐藥突變點T69N (ACT-AAT)野生型測序圖與突變型測序圖之間的比較，進一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。圖8為耐藥突變點M184V (ATG-GTG)野生型測序圖與突變型測序圖之間的比較，進一步證明HIV-I耐藥野生型基因構(gòu)建成功。圖9為耐本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種HIV?1耐藥野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步驟：（1）?把HIV?1耐藥野生型基因,分成若干N段（n=20?40）的A堿基片段,即?A1，A2，A3，A4，A5…An,并進行人工合成，設(shè)計并人工合成與上述片段互補的N?1堿基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn?1?；其中，任一Bn堿基片段的5’端比各耐藥野生型基因片段的An堿基片段5’端后移20?25bp；Bn堿基片段的端延伸到耐藥野生型基因片段的An+1堿基片段5’端20?25bp，根據(jù)上述相互匹配的兩兩對應(yīng)互補片段設(shè)計并合成正向、反向引物；（2）將上述相互對應(yīng)部分互補的堿基片段分別進行PCR擴增，即A1/B1,?A2/B2,?A3/B3……?An/Bn,由部分互補變?yōu)橥耆パa片段；?（3）再將上述具有互補片段的相鄰擴增產(chǎn)物，二次擴增；（4）以3個A堿基片段為單位分別合成167bp片段，并需要進行瓊脂糖凝膠的割膠回收純化，標記為C1，C2，C4，C5…Cn/3,?最后一個An片段可與Cn/3連接；（5）再運用PCR分別兩兩擴增C1和C2；C3和C4，C5和C6，C7和C8，C9和C10各可得到309bp片段，標記為D1，D2，D3，D4，D5；（6）再運用PCR分別兩兩擴增D1和D2，D3和D4可得598bp片段，標記為E1，E2，D5跟E2連接可得F1=887bp；（7）最后將E1和F1進行PCR連接就可以得到1508bp的片段；（8）將片段插入TA載體中，并鑒定野生型模板是否構(gòu)建正確。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種HIV-I耐藥野生型基因合成方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)把HIV-I耐藥野生型基因，分成若干N段(n=20-40)的A堿基片段，即Al，A2，A3，A4，A5…An,并進行人工合成， 設(shè)計并人工合成與上述片段互補的N-I堿基片段，即B1，B2，B3，B4…Bn-I ;其中，任一Bn堿基片段的5’端比各耐藥野生型基因片段的An堿基片段5’端后移20_25bp ;Bn堿基片段的端延伸到耐藥野生型基因片段的An+1堿基片段5’端20-25bp， 根據(jù)上述相互匹配的兩兩對應(yīng)互補片段設(shè)計并合成正向、反向引物； (2)將上述相互對應(yīng)部分互補的堿基片段分別進行PCR擴增，即Al/Bl，A2/B2,A3/B3……An/Bn，由部分互補變?yōu)橥耆パa片段； (3)再將上述具有互補片段的相鄰擴增產(chǎn)物，二次擴增； (4)以3個A堿基片段為單位分別合成167bp片段，并需要進行瓊脂糖凝膠的割膠回收純化，標記為Cl，C2, C4，C5…Cn/3，最后一個A...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李凱，張佳，季曉英，
申請(專利權(quán))人：蘇州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：