本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法。該方法在細胞裂解以前先對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們糞便樣品中分離出來，避免了純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低的問題。本發(fā)明專利技術(shù)提取過程不使用酚、氯仿，減少了對實驗人員的身體健康傷害。所提取的腸道微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近標準值，可直接應用于分子操作，以評價動物腸道微生物群落多樣性。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法。
技術(shù)介紹
動物腸道內(nèi)存在著大量的微生物菌群，這些微生物對機體的營養(yǎng)、免疫、生長發(fā)育等方面有著巨大的影響。它們的分離和鑒定對于研究腸道菌群功能及與機體的相互關系非常重要。傳統(tǒng)方法主要是把腸道微生物通過選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)后，再進行純菌的分類 鑒定。該技術(shù)不僅費時、費力，只能檢測可培養(yǎng)微生物，而對腸道中大量未知的不可培養(yǎng)微生物無能為力。隨著近年來現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，大量分子生物學技術(shù)應用于腸道微生態(tài)學研究中，從動物腸道中提取基因組DNA是非常有用的方法，可用于檢測不可培養(yǎng)的微生物，反映腸道微生物之間及微生物與宿主間的真實相互關系，使我們能夠?qū)δc道微生物有更完整的評價，也可以用來揭示腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨腸道環(huán)境的變化。這就要求從動物糞便樣品中抽提和純化腸道微生物基因組DNA。通過對樣品中微生物基因組DNA的研究從而間接了解其中微生物的分布和組成情況。而建立高效、準確的微生物基因組DNA間接提取方法也成為了腸道微生物分子生態(tài)學研究的一個技術(shù)關鍵所在。基因組DNA提取的主要目標是獲得最高的DNA回收，從而從微生物群落中獲得最具代表性的DNA，并進行進一步的分子操作(如PCR、SSCP, DGGE, TGGE, AFLP等)。但是來自動物腸道的樣品含有非常復雜的成分，尤其是脂類、酸類等有機物質(zhì)在基因組DNA提取過程中很難去除，直接影響后續(xù)的PCR擴增、雜交、內(nèi)切酶消化和細菌轉(zhuǎn)化等。此外，細胞裂解后粗提DNA的每一個純化步驟，例如在DNA分子研究之前進行的重復性純化步驟，不可避免的引起了 DNA的損失。大部分基因組DNA提取方法全都存在缺陷，例如細胞裂解不完全，DNA吸附于樣品表層，樣品提取物中含有酶抑制劑以及DNA的丟失、降解和剪切。另外，目前還大多沿用傳統(tǒng)的DNA制備方法，即酚/氯仿抽提法。該技術(shù)操作步驟復雜，樣品需要量大，DNA收率低，難以快速處理大量標本。另外，酚、氯仿等有機溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者的健康。因此，需要研究適用于動物腸道微生物DNA提取的方便、快捷、實用的方法，以解決使用常規(guī)方法所獲得的DNA樣品存在酸類等PCR抑制物以及細胞裂解率低、DNA損失嚴重等問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題在于提供一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法，利用細菌的平均密度(I. I U g/cm3)小于糞便樣品的平均密度(I. 7-2. 3 ii g/cm3)，在細胞裂解以前對樣品進行前處理，將微生物細胞從它們腸道樣品中分離出來，以解決在腸道微生物細胞裂解后，純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低等問題。為了達到上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。所述的用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法，包括以下步驟I)向0. I-IOg動物糞便樣品中加入0. I-IOmL預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩5-20分鐘，然后加入0. I-IOmL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，室溫40_400g離心，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中；2)向上述步驟I)得到的沉淀物中加入0. 2-20mL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，50-400g室溫離心10分鐘，取上清液與步驟I)所得上清液合并；3)將上述步驟2)得到的上清液室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以回收菌體細胞；4)向上述步驟3)回收得到的菌體細胞中加入I-IOOml的洗滌液C，洗滌2_10分鐘，室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以沉淀菌體細胞，其中洗滌液C為lg/L的焦磷酸鈉；5)向上述步驟4)得到的沉淀后的菌體細胞中加入20-200ul 50mg/ml的溶菌酶和10-50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20_40°C水浴10-40分鐘，然后加入50-500 細胞裂解液D,輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rpm離心5_10分鐘,沉淀碎片；6)將上述步驟5)得到的上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入100-1500 U I蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rpm離心3_10分鐘以沉淀蛋白質(zhì)；7)將上述步驟6)得到的上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入2-5倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒1-5分鐘混勻；8)將上述步驟7)得到混合液加入一個含結(jié)合柱的收集管中，室溫放置1-5分鐘，3000-10000rpm離心1_3分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢；9)將上述步驟8)含結(jié)合柱的收集管放置在一個新的離心管中，加入300-700 ill洗滌液G到結(jié)合柱中，10000-13000rpm離心，倒掉收集管中的廢液；10)將上述步驟9)的結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入400-750 i! I洗滌液H到結(jié)合柱中，8000-18000rpm離心，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次；11)將上述步驟10)的結(jié)合柱重新放回收集管，8000-18000rpm離心1-5分鐘；12)將上述步驟11)的結(jié)合柱裝入新的離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 u I洗脫液I，不戳破膜，室溫放置，8000-15000rpm離心1_3分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C ;其中洗脫液I為0. ImM的Tris-HCl，pH=9. O。其中，上述間接提取方法中，所述勻漿緩沖液A由20-400mM Tris、15_200mM EDTA,50-350mM NaCl、0. 5-3%pvpp,0. 1-1% TEEPOL(R) 6IOS 組成，pH=6. 0-9. 0，其中 pvpp 的單位為 g/L ;優(yōu)選由 200mM Tris、100mMEDTA、200mM NaCl、2%pvpp、0. 5%TEEP0L(R)6IOS 組成，pH=7. 5。所述勻漿緩沖液B 由 10-200mM Tris、5_100mM EDTA、25_350mM NaCl,0. 2-1. 5%pvpp 組成，0. 1-1%TEEP0L(R)610 S 組成，pH=6. 0-9. 0 ;優(yōu)選由 IOOmM TrisUOOmMEDTA、150mMNaCl、l%pvpp、0. 5%TEEP0L(R) 6IOS 組成，pH=7. 5。所述細胞裂解液D由 lwt%SDS(十二烷基硫酸鈉)、20-60mM Tris、100_200mM NaCl,40-100mM EDTA 組成，pH=8. 0 ;優(yōu)選由 lwt%SDS、40mMTris、150mM NaCl、60mM EDTA 組成，pH=8. O0所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2_8wt%冰醋酸組成；優(yōu)選由3M KAc、4wt%冰醋酸組成。所述DNA聯(lián)接液F由5-10M異硫氰酸胍、200_600mM醋酸鉀組成，pH=4. 5-6. 0 ;優(yōu)選由8M異硫氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH=5. 5。所述洗滌液G由6M異硫氰酸胍、23mM檸檬酸鈉組成。所述洗漆液H由70wt%乙醇、150mM醋酸鉀組成，pH本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法，其特征在于，包括以下步驟：1）向0.1?10g動物糞便樣品中加入0.1?10mL預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩5?20分鐘，然后加入0.1?10mL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5?20分鐘，室溫40?400g離心，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中；2）向上述步驟1）得到的沉淀物中加入0.2?20mL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5?20分鐘，室溫50?400g離心，取上清液與步驟1）所得上清液合并；3）將上述步驟2）得到的上清液室溫下6000?15000rpm離心10?60分鐘以回收菌體細胞；4）向上述步驟3）回收得到的菌體細胞中加入1?100ml的洗滌液C，洗滌2?10分鐘，室溫下6000?15000rpm離心10?60分鐘以沉淀菌體細胞，其中洗滌液C為1g/L的焦磷酸鈉；5）向上述步驟4）得到的沉淀后的菌體細胞中加入20?200ul?50mg/ml的溶菌酶和10?50ul?20mg/ml的蛋白酶K，20?40℃水浴10?40分鐘，然后加入50?500μl細胞裂解液D，輕輕顛倒混勻1?10分鐘，6000?15000rpm離心5?10分鐘，沉淀碎片；6）將上述步驟5）離心得到的上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入100?1500μl蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻，室溫放置5?10分鐘，8000?15000rpm離心3?10分鐘以沉淀蛋白質(zhì)；7）將上述步驟6）得到的上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入2?5倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒1?5分鐘混勻；8）將上述步驟7）得到混合液加入一個含結(jié)合柱的收集管中，室溫放置1?5分鐘，3000?10000rpm離心1?3分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢；9）將上述步驟8）含結(jié)合柱的的收集管放置在一個新的離心管中，加入300?700μl洗滌液G到結(jié)合柱中，10000?13000rpm離心，倒掉收集管中的廢液；10）將上述步驟9）的結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入400?750μl洗滌 液H到結(jié)合柱中，8000?18000rpm離心，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次；11）將上述步驟10）的結(jié)合柱重新放回收集管，8000?18000rpm離心1?5分鐘；12）將上述步驟11）的結(jié)合柱裝入一新的離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30?50μl洗脫液I，不戳破膜，室溫放置，8000?15000rpm離心1?3分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于?20℃；其中洗脫液I為0.1mM的Tris?HCl，pH=9.0。...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的微生物基因組DNA間接提取方法，其特征在于，包括以下步驟 1)向O.I-IOg動物糞便樣品中加入O. I-IOmL預冷的無菌水混勻后，漩渦震蕩5_20分鐘，然后加入O. I-IOmL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，室溫40_400g離心，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中； 2)向上述步驟I)得到的沉淀物中加入O.2-20mL預冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，室溫50-400g離心，取上清液與步驟I)所得上清液合并； 3)將上述步驟2)得到的上清液室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以回收菌體細胞； 4)向上述步驟3)回收得到的菌體細胞中加入I-IOOml的洗滌液C，洗滌2_10分鐘，室溫下6000-15000rpm離心10-60分鐘以沉淀菌體細胞，其中洗滌液C為lg/L的焦磷酸鈉； 5)向上述步驟4)得到的沉淀后的菌體細胞中加入20-200ul50mg/ml的溶菌酶和10-50ul 20mg/ml的蛋白酶K，20_40°C水浴10-40分鐘，然后加入50-500 μ I細胞裂解液D，輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rpm離心5_10分鐘,沉淀碎片； 6)將上述步驟5)離心得到的上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入100-1500μ I蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rpm離心3_10分鐘以沉淀蛋白質(zhì)； 7)將上述步驟6)得到的上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入2-5倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中,用手顛倒1-5分鐘混勻； 8)將上述步驟7)得到混合液加入一個含結(jié)合柱的收集管中，室溫放置1-5分鐘，3000-10000rpm離心1_3分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢； 9)將上述步驟8)含結(jié)合柱的的收集管放置在一個新的離心管中，加入300-700μ I洗滌液G到結(jié)合柱中，10000-13000rpm離心，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王金斌，唐雪明，李文，祝子坪，李鵬，劉華，白藍，蔣瑋，何建華，陳大超，趙凱，
申請(專利權(quán))人：上海市農(nóng)業(yè)科學院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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