GNRH（促性腺激素釋放激素）肽衍生物制造技術

本申請涉及GNRH（促性腺激素釋放激素）肽衍生物。本發明專利技術人發現，取代GnRH?I（促性腺激素釋放激素）肽序列的位置5和／或7和／或8的氨基酸殘基，以及特別地除去位置8的精氨酸殘基可引起增強的抗增殖活性。而且，在GnRH?II肽序列的位置6引入一定的D-氨基酸殘基可引起增強的抗增殖活性。這個令人驚奇的發現提供了用于治療抗增殖性失調例如癌癥的有力的和選擇性的試劑。

【技術實現步驟摘要】
GNRH (促性腺激素釋放激素)肽衍生物本申請是申請號為200780026537. 3，申請日為2007年5月I日，專利技術名稱為“GNRH (促性腺激素釋放激素)肽衍生物”的中國專利申請的分案申請。
本申請涉及用于藥物的試劑、組合物和方法。特別地，本專利技術涉及與GnRH肽相關的試劑。
技術介紹
在人類中至少存在兩種形式的促性腺激素釋放激素(GnRH)。雖然對GnRH II的生物學作用知之甚少，但是我們知道GnRH I是哺乳動物繁殖的神經內分泌控制的中心調節子。從下丘腦神經元釋放的GnRH I與垂體前葉(anterior pituitary)中的它的特異性的、G蛋白偶聯受體(GPCR)相結合，最終促進促性腺激素的合成和釋放(Kaiser等人，1997 ； Millar等人,2004)。GnRH另外還對垂體外組織(extra-pituitary tissues)和幾種類型的癌癥，特別是生殖系統癌癥具有效應。在這些腫瘤中已經發現了激素的mRNA和受體，在體外和體內已經表明GnRH對細胞生長的直接的抑制(Limonta等人,2003和Grundker等人， 2002進行了綜述)。對這個新型作用的研究是非常新的，產生了相反的數據收集。例如，在腫瘤細胞中發現兩個不同的結合位點和藥理學上不同的受體，這引起一些研究者建議第二種受體亞型(命名為II型，以與I型垂體受體相對)(Enomoto等人,2004 ；Grundker等人， 2004 ；Neill等人，2004)。但是，雖然在一些靈長類中已經克隆了 II型受體，但是在人類中還沒有發現功能性替代亞型(Morgan等人，2003)。而且，在婦科癌癥中發現的mRNA和cDNA 對應于I型受體(Limonta等人，2003)。GnRH調節其抗增殖作用的分子機制也是一個爭論的問題。一些證據表明，不像垂體受體(其結合至Gq) (Grundker等人,2002 ；Limonta等人,2003),在腫瘤中表達的受體主要結合至Gi。其他待激活的多種細胞內途徑已經被命名，包括生長因子作用的下調 (通過生長因子及其受體表達的減少和磷酸化酪氨酸磷酸酶的激活)、Akt和60s核糖體磷酸化蛋白的抑制(分別抑制細胞生存和蛋白合成)和幾個促有絲分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases,MAPK)的激活(Grundker 2001 ;Chen等人，2002Kim 等人,2004b ;Kimura等人，1999 ;Kraus等人,2004Tanaka等人,2003)。細胞生長調節之上的 GnRH暴露的結果毫無疑問由細胞類型(規定細胞內的內容和類固醇激素對增殖的依賴性)、 治療體制和其他的(有時為未明的)因素決定。GB 2，237，571A涉及促性腺激素釋放激素類似物。Folkers等人(1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，82:1070-1074)涉及與促黃體化激素釋放激素生物學等價的十肽。 Millar等人(1989，J. Biol. Chem. ,35:21007-21013)涉及脊椎動物促性腺激素釋放激素的嵌合類似物。以前已經將GnRH肽用于治療增殖性失調(通過調節垂體腺的激素釋放)，例如癌癥。但是，最近證明抗增殖也是配體的一個內在特性，其能夠優先激活特定的信號級聯反應，該事件被稱為配體誘導的選擇性信號傳導的事件(LISS) (Maudsley等人，2004 ； Millar&Pawson，2004)。這解釋了被刻畫為拮抗劑的配體是如何通過相同的受體進行對其他細胞類型細胞的細胞生長抑制，因為他們不激活垂體受體。迄今為止，鑒定出極少的具有這些特性的配體。
技術實現思路
本專利技術人確定了與細胞生長抑制相關的GnRH I和GnRH II肽的結構性要求并令人驚奇地發現，GnRH I和GnRH II肽的抗增殖活性可通過取代肽序列中的特定氨基酸殘基來進行調節。人類GnRH I的肽序列(使用氨基酸殘基的三字符密碼子進行顯示)為PG1U-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly. NH20人類GnRH II的肽序列(使用氨基酸殘基的三字符密碼子進行顯示)為pGlu_His -Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly. NH20特別地，本專利技術人發現，在GnRH I肽序列的位置5和/或7和/或8取代氨基酸殘基(特別地在位置8除去精氨酸殘基)可導致增強的抗增殖活性。而且，在GnRH II肽序列的位置6引入一定的D-氨基酸殘基可導致增強的抗增殖活性。這個令人驚奇的發現提供了用于治療抗增殖性失調(例如癌癥)的有力的和選擇性試劑。相應地，在第一個方面，本專利技術提供了用于藥物的包含以下肽序列的試劑pGlu-His-Trp-Ser-Rl-Gly-R2-R3-Pro-A，其中a) Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Arg ;或b) Rl 是 Tyr，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或c) Rl 是 Tyr，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或d) Rl 是 His，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或e) Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或f) Rl 是 Tyr, R2 是 Trp 和 R3 是 Tyr ；且其中A選自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或β Ala. Z ;或Pro ;或Pro. ZDAla-Gly. Z ;或Gly. Z,其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。優選地，Z具有小于200的分子量，優選為小于150，優選為小于100。優選地，Z是 NHR’，其中R’是H或C1至C4烷基或者Z是0R”，其中R” C1至C4烷基。優選地，Z是酰胺。 優選地，Z是NH2或N-丙胺或N-乙胺(NHEt)或N-甲胺或N- 丁胺。縮寫“pGlu”代表經修飾的氨基酸，焦谷氨酸鹽(pyroglutamate )。優選地,A是azaGly. NH2。縮寫“azaGly”代表氮雜甘氨酸(azaglycine),其中C-H 基團被氮原子所取代。縮寫“azaGly. NH2”代表氮雜甘氨酸的酰胺化形式。優選地，A是 DAla. NH2 或 Glu. NH2。縮寫 “DAla. NH2” 和 “Glu. NH2” 代表分別 D-丙氨酸殘基和谷氨酸鹽殘基的酰胺化形式。優選地，A是 DAla-Glu. NH2 或 DAla-DAla. NH2 或 DAla-Gly. NH2。優選地，A是β Ala. NH2。縮寫“ β Ala”代表β -丙氨酸，丙氨酸的一種經修飾的形式，其中氨基基團位于相對于羧基基團的β (貝塔)位置。縮寫“i3Ala.NH2”代表β-丙氨酸的氨酰化形式。優選地，A是Pro. Z，其中Z選自NH2、N-丙胺、N-乙胺、N-甲胺或N- 丁胺。縮寫“Gly. NH2”代表甘氨酸殘基的酰胺化形式。優選地，本專利技術的試劑在其C末端含有不帶電的C末端殘基，這可通過用C末端基團例如NH2或NHEt (N-乙胺)進行修飾本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種包含選自以下肽序列的試劑：w）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DArg?LTrp?LTyr?LPro.Y；x）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DArg?LTrp?LTyr?LPro?A；y）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DArg?LLeu?LArg?LPro?A；z）pLGlu?LHis?LTrp?LSer?LHis?DSer?LTrp?LTyr?LPro?A；其中，Y是NHEt或NH2或DAla.NH2或Z；且A選自：Z；或azaGly；或azaGly.Z；或DAla.Z；或Glu.Z；或DAla?Glu.Z；或DAla?DAla.Z；或βAla.Z；或Pro；或Pro.Z；或DAla?Gly.Z；或Gly.Z，其中Z是除去了C末端氨基酸殘基上電荷的基團。

【技術特征摘要】
2006.08.12 GB 0616111.1;2006.06.16 US 60/805,042;1.一種包含選自以下肽序列的試劑w) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. Y ； x)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ； y) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-A ； z) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-A ； 其中，Y是NHEt或NH2或DAla. NH2或Z ;且A選自 Z ;或 azaGly ;或 azaGly. Z ;或 DAla. Z ;或 Glu. Z ;或 DAla-Glu. Z ;或 DAla-DAla. Z ;或 3 Ala. Z ;或 Pro ;或 Pro. Z ;或 DAla-Gly. Z ;或 Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。2.根據權利要求I所述的試劑，其中Z是NH2或NHEt。3.根據權利要求I或2所述的試劑，其中肽序列選自wl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro. NHEt ；xl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH2 ；yl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LLeu-LArg-LPro-Gly. NH2 ；zl) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DSer-LTrp-LTyr-LPro-Gly. NH204.一種用于藥物的包含肽序列pGlu-His-Trp-Ser-Rl-Gly-R2-R3-Pro_A的試劑，其中 a)Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Arg ;或 b)Rl 是 Tyr，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或 c)Rl 是 Tyr，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或 d)Rl 是 His，R2 是 Trp 和 R3 是 Arg ;或 e)Rl 是 His，R2 是 Leu 和 R3 是 Tyr ;或f)Rl 是 Tyr, R2 是 Trp 和 R3 是 Tyr ； 且其中A選自 Z ;或 azaGly ;或 azaGly. Z ;或 DAla. Z ;或 Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或.3 Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。5.一種用于藥物的包含妝序列 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr/His_Gly-Leu/Trp-R4-Pro-A的試劑，其中R4是除了精氨酸以外的任何氨基酸，且A選自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或3 Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z, 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。6.根據權利要求5所述的試劑，其中R4選自丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、色氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。7.根據權利要求4至6任一項所述的試劑，其中Z是NH2或NHEt。8.根據權利要求4至7任一項所述的試劑，其中肽序列選自 al) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly. NH2 ；bl) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Arg-Pro-Gly. NH2 ；cl) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Pro-Gly. NH2 ；dl) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Arg-Pro-Gly. NH2 ；el) pGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Tyr-Pro-Gly. NH2或f I) pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly. NH209.一種包含以下肽序列的試劑在制備用于治療增殖性失調的藥物中的用途pLGlu-LHi s-LTrp-LSer-LHi s-X-LTrp-LTyr-LPro-A，其中 X 是 D-氨基酸殘基，且 A 選自Z ;或azaGly ;或azaGly. Z ;或DAla. Z ;或Glu. Z ;或DAla-Glu. Z ;或DAla-DAla. Z ;或3Ala. Z ;或Pro ;或Pro. Z ;或DAla-Gly. Z ;或Gly. Z， 其中Z是除去了 C末端氨基酸殘基上電荷的基團。10.根據權利要求9所述的用途，其中X選自D-精氨酸、D-賴氨酸、D-色氨酸、D-賴氨酸、D-酪氨酸、D-丙氨酸、D-絲氨酸。11.一種包含選自以下肽序列的試劑在制備用于治療增殖性失調的藥物中的用途i)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DArg-LTrp-LTyr-LPro-A ；ii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LHis-DTrp-LTrp-LTyr-LPro-A ；iii)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LGln-LPro-A ；iv)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LLeu-LPro-A ；v)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LTyr-LPro-A ；v-B ) pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DLys-LTrp-LArg-LPro-A ；vi)pLGlu-LHis-LTrp-LSer-LTyr-DTrp-LTrp-LArg-LPro-A ；vii)pLGlu-LHis-LTrp-LS...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·P·米勒，S·R·莫茲利，R·洛佩斯德馬圖拉納加門迪亞，
申請(專利權)人：醫療研究局，
類型：發明
國別省市：