游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學發光測定試劑盒及其制備和檢測方法技術

本發明專利技術涉及一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學發光測定試劑盒及其制備和檢測方法，試劑盒包括：第一試劑：含異硫氰酸熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液；第二試劑：含堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液；磁分離試劑：含包被著抗異硫氰酸熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。本發明專利技術還公開了該試劑盒的制備方法和采用該試劑進行游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的檢測方法。相對于現有技術，本發明專利技術準確性更好、精密度更高、靈敏度更高，而且待測樣本無需預稀釋，操作簡單省時，檢測范圍寬，并且成本低。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的檢測方法，檢測用試劑盒以及該試劑盒的制備方法。
技術介紹
人絨毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盤絨毛膜的合體滋養層產生的一種糖蛋白，由α和β 二個單位通過離子鍵和疏水鍵結合在一起。α亞單位是垂體前葉激素所共有,它與FSH、LH、TSH的α亞單位結構相似。β亞單位的結構與LH等的β亞單位不同，在免疫活性上可予區別。血中β亞單位大部分以全分子形式存在，游離態的β亞單位(F-13_HCG)占HCG的I 5%左右。血中游離態的β亞單位是在受孕后6 8天產生，50 80天達到高峰，以后平穩下降，直至孕18周左右穩定于一定濃度。唐氏綜合征又稱先天愚型，21-三體綜合征，是最常見的染色體疾病和弱智的病因，新生兒中發病率約為1/700左右。根據染色體核型的不同，唐氏綜合征分為單純21三體型、嵌合型和易位型三種類型。唐氏綜合征的發生起源于卵子或精子發生的減數分裂過程中染色體的不分離現象，通常是隨機發生的，約95%的不分離現象來源于母親，僅5%左右發生在精子發生期。其結果是21號染色體多了一條，多出的一條染色體因劑量效應破壞了正常基因組遺傳物質間的平衡，導致患兒智力低下，顱面部畸形及特殊面容，肌張力低下，多并發先天性心臟病，患者白血病的發病率為普通人群的10-20倍。生活難以自理，患者預后一般較差，50%左右于5歲前死亡。目前對唐氏綜合征缺乏有效的治療方法。通過孕早、中期檢測孕婦血中ΡΑΡΡ-Α，游離β-HCG，AFP等，結合B超檢查，可將約90%的唐氏綜合征檢測出來。對高風險胎兒，通過絨毛活檢或羊水穿刺或臍血穿刺等技術作染色體核型分析可以確診，然后流產處理。懷有唐氏綜合征(DS)胎兒的孕婦，一部分人其血清F-P-HCG水平呈強直性升高，平均MOM值為2. 3 2. 4Μ0Μ。F-β-HCG在孕早期和孕中期都處于高水平。妊娠中期DS孕婦血清F- β -HCG濃度比正常至少高2倍。F- β -HCG用于DS風險的評估，敏感期可從孕早期到孕中期(7 20周)。目前用于檢測游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位(F-P-HCG)的免疫分析方法主要有酶聯免疫分析法、化學發光免疫分析法等。酶聯免疫分析法存在靈敏度低，線性范圍窄、不易實現全自動化等方法學限制因素。化學發光免疫分析法是在酶聯免疫分析法基礎上發展起來的一種免疫檢測技術，具有靈敏度高、檢測線性范圍寬、操作簡便，自動化程度高等優勢。目前化學發光免疫分析技術因其有上述諸多有點得到了廣泛的應用。然而，在實際的免疫檢測中，由于 待測樣品中所含的雜質成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從復雜的樣品基質中快速分離、純化出目的待測物，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。磁微粒免疫檢測技術是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯等方法包被上具有特異性親和力的抗體或抗原等各種免疫活性物質，具有分離速度快、效率高、可重復性好、操作簡單、不影響被分離細胞或其他生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下可定向運動，是的某些特殊成分得以分離、濃集或純化。
技術實現思路
為了克服現有技術的缺陷，本專利技術的第一個目的是提供一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學發光定量檢測試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠實現游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位準確和高精準地定量測定。本專利技術的第二個目的是提供一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學發光定量檢測試劑盒的簡便和低成本的制備方法。本專利技術的第三個目的是提供一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學發光定量檢測方法，該方法不僅準確性好、靈敏度高，且精密度特別是分析間精密度高，此外該方法成本低。為解決以上技術問題，本專利技術采用如下技術方案一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于，包括如下試劑第一試劑含熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7. 0-9. O的緩沖溶液，所述的熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為 O. 5 I μ g/mL ；第二試劑含堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7. 0-9. O的緩沖溶液，所述的堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為O. 5 I μ g/mL ；磁分離試劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。根據本專利技術，所述的堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體由堿性磷酸酶與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體通過交聯劑琥珀酰亞胺基-4-[Ν-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物和2-亞氨基四氫噻吩連接構成。根據本專利技術，所述包被有熒光素抗體的磁微粒的制備也是較為容易的，且現有技術已有成熟的制備工藝可以參照。例如可以通過常規的物理吸附或化學偶聯包被方式制備，沒有特別限制。作為本專利技術的一種優選實施方案該包被有熒光素抗體的磁微粒中，熒光素抗體與磁微粒之間相化學偶聯。本領域技術人員應知曉，本專利技術的試劑盒還可以進一步包括有其它檢測所需的試齊U，例如底物溶液。但是諸如底物溶液等其它試劑可以另行購買或配制，因此，雖然試劑盒中可以包括這些試劑，但它們對于本專利技術試劑盒來說并非必不可少。本專利技術采取的又一技術方案是一種用于游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位化學發光定量檢測試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述的第一試劑、所述的第二試劑以及所述的磁分離試劑的步驟，其中所述的第二試劑的制備方法如下( I)使游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與交聯劑2-亞氨基四氫噻吩在甘氨酸溶液中，室溫靜置反應，生成游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物，于2-8°C下保存備用；(2)使堿性磷酸酶溶液與交聯劑琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物溶液混合，室溫靜置反應，將反應液通過G-25凝膠柱除鹽，將收集到的堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4- [N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物的連接物于2-8°C下保存備用;(3)將步驟(I)所得溶液與步驟(2)所得溶液按照游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物與堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4-[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物的連接物的摩爾比為1:廣2混合，在2-8°C下反應，使生成所述的堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體，反應結束，將反應液通過Supperdex200凝膠純化柱純化，選擇合適的pH緩沖液調整濃度和pH值即得所述的第二試劑。進一步地，所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、所述的堿性磷酸酶的純度均大于等于95wt%，且所述堿性磷酸酶的比活性超過lOOOu/mg，所述堿性磷酸酶的緩沖液的濃度超過5mg/ml。根據一個具體方面，所述的第一試劑的制備方法如下配制含有熒光素的pH為擴10的緩沖液，然后按照熒光素與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的分子比為2(Γ200:1的比例，將所述含有熒光素的pH為 Γ Ο的緩沖液與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體混合，室溫靜置反應，將反應液通過G-25凝膠柱進行分離，除去游離的熒光素，獲得熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的溶液，接著用具有適當的PH值的緩沖液調整濃度和PH本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學發光測定試劑盒，其特征在于，包括如下試劑：第一試劑：含熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7.0?9.0的緩沖溶液，所述的熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為0.5~1μg/mL；第二試劑：含堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7.0?9.0的緩沖溶液，所述的堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為0.5~1μg/mL；磁分離試劑：含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。

【技術特征摘要】
1.一種游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學發光測定試劑盒，其特征在于，包括如下試劑第一試劑含熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7. 0-9. O的緩沖溶液，所述的熒光素標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為O.5 I μ g/mL ；第二試劑含堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體、pH為7.0-9. O的緩沖溶液，所述的堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體的濃度為 O. 5 μ g/mL ；磁分離試劑含包被著熒光素抗體的磁微粒的懸浮液。2.根據權利要求1所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學發光測定試劑盒，其特征在于所述的堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體由堿性磷酸酶與游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體通過交聯劑琥珀酰亞胺基-4-[Ν-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物和2-亞氨基四氫噻吩連接構成。3.根據權利要求1所述的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位的納米磁微粒化學發光測定試劑盒，其特征在于所述的包被著熒光素抗體的磁微粒中，熒光素抗體與磁微粒之間化學偶聯。4.一種如權利要求1-3中任一項所述的試劑盒的制備方法，其包括分別制備所述的第一試劑、所述的第二試劑以及所述的磁分離試劑的步驟，其特征在于所述的第二試劑的制備方法如下(I)使游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與交聯劑2-亞氨基四氫噻吩在甘氨酸溶液中，室溫靜置反應，生成游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物，于2-8°C下保存備用；(2 )使堿性磷酸酶溶液與交聯劑琥珀酰亞胺基-4- [N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物溶液混合，室溫靜置反應，將反應液通過G-25凝膠柱除鹽，將收集到的堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4_[N-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物的連接物于2-8°C下保存備用；(3)將步驟(I)所得溶液與步驟(2)所得溶液按照游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體與2-亞氨基四氫噻吩的連接物與堿性磷酸酶與琥珀酰亞胺基-4-[Ν-馬來酰亞胺甲基]環己烷-1-羧化物的連接物的摩爾比為1:廣2混合，在2-8°C下反應，使生成所述的堿性磷酸酶標記的游離人絨毛膜促性腺激素β亞單位抗體，反應結束，將反應液通過Supperdex200凝膠純化柱純化，選擇合適的pH緩沖液調整濃度和pH值即得所述的第二試劑。5.根據權利要求4所述的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：于大為，程曉蕾，
申請(專利權)人：蘇州浩歐博生物醫藥有限公司，
類型：發明
國別省市：