本發明專利技術涉及蛋白領域，具體涉及一種具有體外抗氧化活性和促進機體免疫力活性的乳源性生物活性多肽QEPVL，其氨基酸序列為Gln-Glu-Pro-Val-Leu。經過體外抗氧化實驗、體外免疫功能促進實驗，驗證了多肽QEPVL具有較好的抗氧化生物學活性和提高免疫力的功能，一方面能夠清除機體內的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發明專利技術的生物活性多肽QEPVL還能夠增強機體免疫力，促進體外淋巴細胞的增殖能力，提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發病率，而且不會引起機體的免疫排斥反應。對開發具有抗氧化功能及增強免疫功能的乳制品、保健品和藥品具有十分重要的意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及蛋白領域，具體涉及一種生物活性多肽QEPVL及其制備和應用。
技術介紹
在牛乳經乳酸菌發酵的過程中，牛乳中的一部分蛋白質被乳酸菌代謝利用，并發生了一系列生理生化反應，使蛋白質變為多肽或者游離的氨基酸，被人體消化吸收或通過小腸上皮細胞的吸收轉運直接進入人體的血液循環。在這些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被稱為“生物活性肽”。 氧化反應和氧化代謝對于食物和人體來說都是至關重要的，自由基和活性氧引起了一系列的氧化反應。當過量的自由基形成，它們會超過保護性酶如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的保護作用，從而導致脂質氧化、細胞凋亡等一系列的副作用產生。這一類的氧化反應，不僅影響含脂食物的保質期，也對人體的健康造成了一定的危害，如風濕性關節炎、糖尿病、動脈硬化等。此外，Collins等人2005年研究發現癌癥的發生也與DNA的氧化損傷有關。早期一些人工合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)、2，6- 二叔丁基_4_甲基苯酚(BHT)被運用到食品中，作為脂質的抗氧化劑，但這些人工合成的添加劑對于人體都有潛在的風險。因此，在天然食物來源中尋找安全的抗氧化劑尤為重要。近些年來，人們發現一些食物來源的多肽類物質具有良好的抗氧化作用，如玉米短肽、大豆肽、牛乳多肽等。這些多肽可以通過微生物發酵、消化酶解等多種途徑得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2 20個氨基酸殘基組成，分子量小于6000Da，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸。免疫活性肽是繼阿片肽發現后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生物活性多肽。1981年Jolles等人首次發現，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一個氨基酸序列為Val-Glu-PiO-Ile-PiO-Tyr的六肽，體外實驗證明該肽能夠增強小鼠腹腔巨曬細胞對綿羊血紅細胞的吞曬作用。Migliore-Samour等人發現來自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能夠刺激綿羊血紅細胞對小鼠腹膜巨噬細胞的吞噬作用以及增強對于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫調節肽(PGPIPN)飼喂大鼠發現大鼠腹腔巨噬細胞的吞噬作用和紅細胞相關的免疫調節功能有顯著的增強。研究表明，免疫活性肽不僅能夠增強機體免疫力，刺激機體淋巴細胞的增殖，增強巨噬細胞的吞噬功能，促進細胞因子的釋放、提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發病率，而且不會引起機體的免疫排斥反應。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Gln-Glu-Pro-Val-Leu (QEPVL) (SEQ ID NO 1)0較優的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。本專利技術的生物活性多肽QEPVL為乳源性，具體來源于β-酪蛋白，并且為β-酪蛋白第209 213位的氨基酸殘基。較優的，所述生物活性多肽具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功能。本專利技術的生物活性多肽可以通過基因工程的方法和化學方法人工合成，也可以從乳制品中通過分離純化的方法直接獲得。本專利技術還公開了編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段。酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列為既有技術，編碼酪蛋白(SEQ IDNO: 3)第209 213位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽QEPVL。進一步的,編碼前述生物活性多肽的核苷酸片段,其序列為5‘_cag gag cct gtactc-3’ (SEQ ID N0:2)。 本專利技術第二方面公開了前述生物活性多肽的制備方法，步驟如下I)發酵將瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)添加到脫脂乳中進行厭氧發酵，獲得瑞士乳桿菌發酵乳；2)多肽的粗提對步驟I)的瑞士乳桿菌發酵乳進行低溫離心分離，取上清液；3)多肽的純化a.對步驟2)的上清液進行超濾處理，收集濾液；b.收集的濾液采用反向層析柱S0URSE5RPC ST (4. 6X 150mm)進行反相高效液相色譜分離，收集生物活性多肽QEPVL。本專利技術所述脫脂乳為經過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于O. 1%。較優的，步驟I)所述厭氧發酵的條件為發酵溫度36 38°C，發酵培養15 20h ；優選發酵培養19h。較優的，步驟2)所述低溫離心的條件為4°C,8000 IOOOOrpm,離心15 30min。較優的，步驟3) a所述超濾法所采用的濾膜的截留分子量分別為IOkDa和3kDa。本專利技術采用截留分子量分別為10kDa、3kDa的濾膜，使樣品依次通過兩張濾膜進行超濾。更優的，步驟3) a所述超濾過程中，壓力范圍為O. Γθ. 3MPa，濾液流速為O. 8 I. 2mL/min。較優的，步驟3 ) b反相高效液相色譜分離法中，流動相A為含有2%乙腈和O. 05%TFA的ddH20 ;流動相B為100%乙腈。較優的，步驟3) b反相高效液相色譜分離法中，收集分子量為585. 32Da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽QEPVL。在本專利技術反相高效液相色譜法分離過程中，已知QEPVL的分子量，收集分子大小為585.32Da的洗脫峰，即為本專利技術的生物活性多肽QEPVL。具體的，本專利技術分子大小為585. 32Da的洗脫峰其保留時間為33min。本專利技術第三方面公開了前述生物活性多肽在制備抗氧化和/或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應用。本專利技術的生物活性多肽QEPVL在體外模擬胃腸道消化條件下可以被消化酶降解，獲得生物活性多肽QEPV。并且，本專利技術通過實驗證實不僅生物活性多肽QEPVL本身具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功能，其經人體消化道消化后的產物QEPV也同樣具有體外抗氧化活性和增強機體免疫力的功能。因此，生物活性多肽QEPVL在體內消化過程中可以先被消化酶消化降解，然后被動物機體吸收，繼續發揮其生物活性。本專利技術的生物活性多肽QEPVL可以用于制備減少自由基對皮膚傷害的化妝品、制備具有抗氧化和/或增強機體免疫力的注射類藥物；并且由于本專利技術的生物活性多肽QEPVL通過胃腸道降解后的產物仍舊具有生物活性，因此還可以用于制備酸奶等食品、提高免疫力的保健品，以及口服的用于制備具有抗氧化和/或增強機體免疫力的藥物。本專利技術第四方面公開了一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽QEPVL或前述生物活性多肽QEPVL的衍生物。本專利技術第五方面公開了一種增強機體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽QEPVL或前述生物活性多肽QEPVL的衍生物。 所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸側鏈基團上、氨基端或羧基端進行羥基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。本專利技術生物活性多肽QEPVL的有益效果為本專利技術的乳源性生物活性多肽QEPVL具有較好的抗氧化活性和促進機體免疫力活性；一方面能夠清除機體內的自由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本專利技術的生物活性多肽QEPVL還能夠增強機體免疫力，增強淋巴細胞的增殖能力，提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發病率，而且不會引起機體的免疫排斥反應，對開發具有抗氧化功能及增強免疫功能的乳制品、保健品和藥品具有十分重要的意義。附圖說明圖I :瑞士乳桿菌發酵乳與未經發酵處理的脫脂乳超濾后粗提物的質譜對比圖(A 3000Da未經發酵的脫脂乳粗提物質譜圖，B 30本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種生物活性多肽，其氨基酸序列為Gln？Glu？Pro？Val？Leu。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張少輝，盧姍姍，馬鎏镠，孫冠華，崔磊，余芳，周婕慧，
申請(專利權)人：上海交通大學，
類型：發明
國別省市：
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