一種提高靈芝菌絲生長速度和液體發酵生物量的方法，屬于微生物遺傳育種方法。該方法包括步驟：（1）靈芝原生質體制備；（2）亞硝酸誘變靈芝原生質體、原生質體再生；（3）接種花生粕斜面培養基培養，該培養基由玉米、花生粕、KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB2組成；（4）接種花生粕液體發酵培養基培養，該培養基由玉米、花生粕、蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O組成；（5）獲得生物量和多糖、三萜類化合物等活性產物。優點：（1）本發明專利技術首次經誘變獲得了菌絲生長速度快、生物量高的靈芝菌株；（2）采用的花生粕斜面培養基較馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基更有利于靈芝菌絲快速生長；（3）采用的花生粕液體發酵培養基更有利于獲得較高的生物量。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種微生物遺傳育種方法，特別是。
技術介紹
含有靈芝多糖、三萜類、靈芝多肽等十多種有效成分，試驗證明靈芝具有抗炎、鎮痛、鎮靜、抗衰老、抗腫瘤、抗缺氧、提高免疫力等作用。液體深層發酵技術是獲得靈芝主要藥理活性物質的重要途徑，但是一方面靈芝菌絲生長速度較慢，與靈芝菌種的大量需求不相符，另一方面發酵后產生的生物量較少，影響菌絲體中的活性物質產量。因此選育菌絲生長速度快且生物量高的靈芝菌種是解決問題的關鍵。原生質體誘變技術是一種行之有效的微生物育種新方法。目前已有靈芝原生質體誘變育種相關報道，但都已獲得較高活性物質產量為根本目的，缺少選育菌絲生長速度快、生物量高方面的研究。
技術實現思路
本專利技術的目的是要提供，解決現有技術中選育菌絲生長速度慢、生物量低的問題。本專利技術的目的是這樣實現的該方法采用靈芝為菌種，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化、液體搖瓶培養后，利用復合酶液水解靈芝菌絲體，在28 32°C下振蕩I. 5 4h，制備原生質體，采用亞硝酸作為誘變劑，誘變靈芝原生質體，選擇生長速度快、菌絲雪白的再生菌落經花生柏斜面培養基、花生柏液體發酵培養基培養，獲得生物量、多糖及三萜類化合物；具體步驟如下 (1)配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基按照GB4789.15-2010《食品衛生微生物學檢驗霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的復蘇及保存；(2)菌種活化取靈芝No.5. 786菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化f 2次；(3)取液體培養的菌絲，過濾收集菌絲球,用無菌水沖洗2 3次，再用甘露醇沖洗2 3 次，轉入巰基乙醇中，恒溫搖床振蕩3(T60min，過濾收集菌絲球，用甘露醇沖洗2 3次，離心分離取沉淀為菌絲體，取菌絲體以1:1(Γ20的比例加入復合酶液，恒溫下振蕩酶解2 4h，過濾后濾液于500 1000r/min離心3 5min,取上清液于3000 4000 r/min,離心5 10 min,沉淀即為原生質體，用甘露醇沖洗并用O. 9%生理鹽水把原生質體稀釋10倍；(4)向原生質體稀釋液中加入等量的O.06moI/LNaNO2和lmol/L醋酸緩沖液，27°C恒溫處理5 25min，再加入兩倍于醋酸緩沖液體積的O. 7mol/L pH 8. 6的Na2HPO4溶液終止誘變； 將誘變后的原生質體分別涂在再生培養基上，27°C培養5天；(5)將生長速度快、菌絲雪白的菌落接種在花生柏斜面培養基上，該培養基組成為玉米 10 30g/L，花生柏 2 5g/L，KH2PO4 I 3 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 I. 5 g/L, VB2 O. 3 O. 8g/L，瓊脂20g/L。27°C培養6 7天得第一代誘變菌株，將其接種新的花生柏斜面培養基上，27°C培養61天得第二代誘變菌株，按同樣方法獲得第三代 第九代菌株；(6)接種第一、三、五、七、九代菌塊于花生柏液體發酵培養基中，該培養基組成為玉米 10 30 g/L，花生柏2 5 g/L，蛋白胨I 3 g/L，葡萄糖10 30 g/L，酵母膏I 3 g/L,KH2PO4 Γ3 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 I. 5 g/L, pH 6· 5，27°C搖床培養 5 7 天；(7)分離生物量發酵液過濾收集菌絲，60°C烘干至質量恒定并稱質量；(8)胞內粗多糖的提取取干菌絲體lg，加入10倍體積蒸餾水，90°C水浴疒3h，4000r/ min離心5 10min，收集上清液，沉淀再重復浸提2次，合并3次的上清液，80^90 °C水浴濃縮成原體積的O. 2^0. 25倍，加入4飛倍體積95%乙醇，4°C靜置，濃縮液離心，用無水乙醇洗滌沉淀兩次，烘干至恒重，得胞內粗多糖；(9)胞內三萜類化合物的提取取干菌絲體Ig加50mL甲醇靜置過夜后過濾，蒸干后加4 mL 95%乙醇溶解；(10)誘變菌株放置石蠟油或砂土管中，4°C保存，每一年傳代一次。有益效果，由于采用上述方案，本專利技術采用的原生質體誘變技術是一種行之有效的微生物育種新方法,原生質體由于去除了細胞壁,對誘變劑敏感性增強,正突變率較高， 更容易獲得具有優良性狀的菌株，靈芝原生質體經亞硝酸誘變后，菌絲生長速度增快且發酵后生物量增加。與其它靈芝誘變菌株相比，本專利技術誘變獲得的靈芝菌株菌絲生長速度快， 經液體發酵后生物量高，遺傳性狀穩定。解決了現有技術中選育菌絲生長速度慢、生物量低的問題，達到了本專利技術的目的。優點 (1)本專利技術首次經誘變獲得了菌絲生長速度快、生物量高的靈芝菌株；(2)采用的花生柏斜面培養基較馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基更有利于靈芝菌絲快速生長;(3)采用的花生柏液體發酵培養基更有利于獲得較高的生物量。具體實施方式下面結合實施例對本專利技術作進一步詳細說明實施例I :I、菌種靈芝(fefloofe/ma JrWciote ):購自中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號為5.786。2、培養基花生柏斜面培養基和花生柏液體發酵培養基所需糧食原料包括玉米、 花生柏，購自超市，玉米、花生柏碎至顆粒大小為100 μ m。花生柏斜面培養基組成為玉米l(T30g/L，花生柏2 5g/L，KH2PO4 I 3 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 I. 5 g/L, VB2 O. 3 O. 8g/L，瓊脂 20g/L。花生柏液體發酵培養基組成為玉米1(T30 g/L，花生柏2 5 g/L，蛋白胨廣3 g/L, 葡萄糖 10 30 g/L，酵母膏 Γ3 g/L, KH2PO4 I 3 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 I. 5 g/L, pH 6. 5。3、亞硝酸誘變靈芝原生質體靈芝菌株在28°C下保溫培養活化菌種7天，取活化后的菌塊接種于三角瓶的液體培養基中，28°C溫度下在搖床上培養5天，過濾收集菌絲體，用甘露醇沖洗后，轉入O. 3%巰基乙醇中，振蕩40min,過濾收集菌絲體,用甘露醇沖洗過濾，1200r/min離心8min。取O. 5g菌絲體以1:15的比例加入復合酶液，28°C振蕩酶解菌絲體3h，濾液1000r/min離心3min，2次。上清液采用3000 r/min離心IOmin制得原生質體。向原生質體稀釋液中加入O. 25mL的 O. 06moI/LNaNO2 和 O. 25mL lmol/L 醋酸緩沖液，27°C恒處理 20min,再加入 ImL O. 7mol/L pH 8. 6的Na2HPO4溶液終止誘變。將誘變后的原生質體分別涂在再生培養基上，27°C培養5天；將生長速度快、菌絲雪白的菌落接在花生柏斜面培養基上，27°C培養6 7天，測定生長速度，取斜面菌塊接種于花生柏液體發酵培養基中，27°C搖床培養5 7天，或IOL發酵罐培養4飛天，發酵液過濾后，菌絲烘干至恒重得生物量。結果表明，靈芝誘變菌株經花生柏斜面培養基培養，3. 5^4. 5天可鋪滿試管斜面，較采用相同培養基培養的原發菌株提前Γ2天，生長速度提高，較采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養的原發菌株提前I. 5^2. 5天，生長速度提高，且菌絲雪白、致密，生長旺盛。靈芝誘變菌株經花生柏液體發酵培養基培養，獲得生物量為4. 2飛.5 (干g/100mL)，較采用相同培養基培養的原發菌株提高89Γ21%，較采用普通本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種提高靈芝菌絲生長速度和液體發酵生物量的方法，其特征是：采用靈芝為菌種，經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基活化、液體搖瓶培養后，利用復合酶液水解靈芝菌絲體，在28~32℃下振蕩1.5~4h，制備原生質體，采用亞硝酸作為誘變劑，誘變靈芝原生質體，選擇生長速度快、菌絲雪白的再生菌落經花生粕斜面培養基、花生粕液體發酵培養基培養，獲得生物量和多糖、三萜類化合物；具體步驟如下：（1）配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基：按照GB4789.15—2010《食品衛生微生物學檢驗?霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的復蘇及保存；（2）菌種活化：取靈芝No.?5.786菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化1~2次；（3）取液體培養的菌絲，過濾收集菌絲球，用無菌水沖洗2~3次，再用甘露醇沖洗2~3次，轉入巰基乙醇中，恒溫搖床振蕩30~60min，過濾收集菌絲球，用甘露醇沖洗2~3次，離心分離取沉淀為菌絲體，取菌絲體以1:10~20的比例加入復合酶液，恒溫下振蕩酶解2~4h，過濾后濾液于500~1000r/min離心3~5min，取上清液于3000~4000?r/min，離心5~10?min，沉淀即為原生質體，用甘露醇沖洗并用0.9％生理鹽水把原生質體稀釋10~15倍；（4）向原生質體稀釋液中加入等量的0.06mol/LNaNO2和1mol/L醋酸緩沖液，27℃恒處理5~25min，再加入兩倍于醋酸緩沖液體積的0.7mol/L?pH?8.6的Na2HPO4溶液終止誘變；將誘變后的原生質體分別涂在再生培養基上，27℃培養5天；（5）將生長速度快、菌絲雪白的菌落接種在花生粕斜面培養基上，該培養基組成為玉米10~30g/L，花生粕2~5g/L，KH2PO4?1~3?g/L，MgSO4·7H2O?0.5~1.5?g/L，VB2?0.3~0.8g/L，瓊脂20g/L。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：苗敬芝，董玉瑋，陳尚龍，李勇，
申請(專利權)人：徐州工程學院，
類型：發明
國別省市：
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