一種DPYD基因多態性檢測特異性引物和液相芯片制造技術

本發明專利技術公開了一種DPYD基因檢測特異性引物和液相芯片，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對G55A位點的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8；針對G141A位點的SEQ?IDNO.9及SEQ?ID?NO.10；和/或針對G134T位點的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12；有anti-tag序列包被的微球；擴增引物。本發明專利技術所提供的檢測液相芯片的檢測結果與測序法的吻合率高達100％，實現多個突變位點的野生型和突變型并行檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種DPYD基因多態性檢測特異性引物和液相芯片。
技術介紹
氟尿嘧啶(5-Fu)是各種腫瘤治療中應用最為廣泛的抗腫瘤藥物之一。體內80%以上的5-Fu在肝臟內經由二氫嘧啶脫氫酶(DPD)分解代謝。二氫嘧啶脫氫酶基因(DPYD基因)所編碼的二氫嘧啶脫氫酶(DB)酶)是氟化嘧啶類抗腫瘤藥物代謝的主要限速酶，其活性存在顯著的個體差異，并因此影響藥物的療效和毒副作用，有研究表明，DPYD基因的多態性與其編碼的酶活顯著相關。本專利技術目標檢測的DPYD基因突變位點，如表所示序號DPYD位點突變的內容簡寫 SEQ ID NO. 29的第55位核苷酸，發生G — A突變G55A ~2SEQ ID NO. 30的第141位核苷酸，發生G — A突變G141A ~SEQ ID NO. 31的第134位核苷酸，發生G — T突變G134TSEQ ID NO. 29-SEQ ID NO. 31 的組成如下SEQ ID NO. 29CACCAAGGTCCTTCATTAGCTCAATCTCAAAATTCACTACATCATACGGCAGCCGGAACTGAGGAATTTCAGAAGTACTGAAAAGAAAGGAGAAAGAAAAACAGGCATCAGTAGAAAAATGACCAATCTTTGACCAATCTTAAAAAAAGGTAACATGTCTTTATGGATTAGTAGAAAATAAATATCTCTTCCAAGGATATTTATATATCACACAAGATATGCATGAGGACA。SEQ ID NO. 30TCCCTAGACACACATTTGTTTGTTGATAATATTTATATGTTTATATCTTCCCATTTTTCTCTTCTCTGAGCTAACATGCTTCCTTATTTGTGTGTTTTCCTTTTAGAAACTGCCAAGTTTTGGACCTTATCTGGAACAGCGCAAGAAAATCATAGCAGAAAACAAGATTAGACTGAAAGAACAAAATGTAGCTTTTTCACCACTTAAGAGAAACTGTTTTATCCCCAAAAGGCCTATTCCTACCATCAAGGTAAAAATTATGCCAACoSEQ ID NO. 31 GGGGACATTGTTGACCTTTGTGGTCAGTGACATCAATACCCTCTATTTCTGTTTGCAGGCTATACAGTTTGATCCAGAAACCCACCTGCCCACCATAACCGACACTTGTACAGGCTGTACTCTGTGTCTCAGTGTTTGCCCTATTGTCGACTGCATCAAAATGGTTTCCAGGACAACACCTTATGAACCAAAGAGAGGCGTACCCTTATCTGTGAATCCGGTGTGTTAAGGTGATTTGTGAAACAGTTGCTGTGAACTTTCATGTCACCTACATATGCTGATCTTTTAAAATCATGATCCTTGTGTTCAGCTCTTTCC。目前，對DPYD基因多態性進行檢測、分析的方法主要有直接測序法和實時熒光定量PCR技術，直接測序法靈敏度只有20%-25%,操作復雜，時效性差，不能滿足實際應用的需要，尤其是對于異質性的腫瘤體細胞突變，低靈敏度將導致大量的漏檢；而實時熒光定量PCR技術，其靈敏度達到1% _2%，檢測效率高，時效性強，但其高居不下的假陽性率也為實際應用所詬病。再次，以上這些方法都存在著檢測通量的局限性，每次只能檢測一種突變類型，不能滿足實際應用的需要。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供DPYD基因多態性檢測液相芯片，該液相芯片可用于并行或單項檢測DPYD基因三種常見基因型G55A、G141A和G134T的野生型和突變型。實現上述目的的技術方案如下。 一種DPYD基因多態性檢測液相芯片，包括有(A).針對DPYD基因不同多態性位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因多態性位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為針對G55A位點的SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8 ;針對G141A位點的SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或針對 G134T 位點的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12 ；所述 tag 序列選自 SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 6 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述anti-tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti-tag序列選自SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 18，且所述anti-tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。優選地，所述擴增引物為針對G55A位點的SEQ ID NO. 19及SEQ ID NO. 20 ;針對G141A 位點的 SEQ ID NO. 21 及 SEQ ID NO. 22 ;和 / 或針對 G134T 位點的 SEQ ID NO. 23 及SEQ IDN0. 24。優選地，所述ASPE弓丨物為針對G55A位點的由SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 7組成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 8組成的序列；針對G141A位點的由SEQ ID NO. 3和SEQ IDN0. 9組成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 10組成的序列；和/或針對G134T位點的由SEQID NO. 5和SEQ ID NO. 11組成的序列及由SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 12組成的序列。本專利技術的另一目的是提供用于DPYD基因多態性檢測的特異性引物。實現上述目的的技術方案如下用于DPYD基因多態性檢測的特異性引物，包括有針對G55A位點的SEQ ID NO. 7及 SEQID NO. 8 ;針對 G141A 位點的 SEQ ID NO. 9 及 SEQ ID NO. 10 ;和 / 或針對 G134T 位點的 SEQ IDNO. 11 及 SEQ ID NO. 12。本專利技術的主要優點在于I.本專利技術所提供的檢測方法與測序法的吻合率高達100%，且檢測所需要的時間遠遠低于常用的測序技術，特別符合實際應用需要。所制備的DPYD基因多態性檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設計的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應，tag標簽序列、anti-tag標簽序列的選取以及tag標簽序列與具體ASPE引物的結合，能夠避免交叉反應，實現多個SNP位點的并行檢測。2.本專利技術通過專利技術人長期積累的設計經驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優的組合。本專利技術設計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標檢測的突變位點，準確區分各種型別的基因型；在同一個反應體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標檢測的PCR擴增產物之間基本上不存在交叉反應，檢測特異性好，交叉反應率低于3% ;除了能夠檢測單個位本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種DPYD基因多態性檢測液相芯片，其特征是，包括有：(A).針對DPYD基因不同多態性位點分別設計的野生型和突變型的ASPE引物：每種ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因多態性位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為：針對G55A位點的SEQ?ID?NO.7及SEQ?ID?NO.8；針對G141A位點的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10；和/或針對G134T位點的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12；所述tag序列選自SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.6；(B).有anti?tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球，所述anti?tag序列與微球連接中間還設有間隔臂序列；所述anti?tag序列選自SEQ?ID?NO.13～SEQ?ID?NO.18，且所述anti?tag序列能相應地與(A)中所選的tag序列互補配對；(C).用于擴增出需要檢測的、具有相應突變位點的目標序列的引物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：許嘉森，吳詩揚，
申請(專利權)人：廣州益善生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：