轉基因棉花多重PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種轉基因棉花的多重PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法，所述引物具有較強的特異性，能夠用于PCR擴增以及DHPLC分析。所述檢測方法提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度高的轉基因棉花檢測方法，實現了轉基因棉花的多靶標檢測。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，其片段大小區分率可達數個堿基，分辨率高。本發明專利技術的引物和檢測方法為轉基因棉花檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的高通量檢測方法，特別適合用于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種轉基因產品的檢測，特別是涉及一種轉基因棉花多重PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法。
技術介紹
目前對轉基因棉花的檢測方法主要包括常規PCR，實時熒光PCR、PCR-基因芯片等。傳統的常規PCR檢測方法的擴展性存在一定的局限，隨著待檢目標的增加，需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進行優化，并且兼顧擴增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴增產物的方法，區分效率不高，檢測結果不理想。實時熒光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較常規PCR檢測方法有優勢，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時提供互不干擾的4個熒光通道，也限制了該技術在檢測通量 擴展。常規的多套PCR-基因芯片檢測方法，需要多套引物進行擴增，操作步驟繁瑣，并不適合大規模的高通量檢測。變性高效液相色譜技術(Denaturing High-performance LiquidChromatography, DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法,分辨率高、擴展性能好、靈敏度高。該技術在50°C條件下分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對的數量決定洗脫順序，當過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會根據分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與marker比較確定分子量大小，判定是否含有目標檢測基因，分辨率高。目前，尚沒有轉基棉花的PCR結合DHPLC的檢測技術(PCR-DHPLC)。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于轉基因棉花的多重PCR-DHPLC檢測的引物。本專利技術的另一目的是提供一種基于上述引物的擴展性能好、靈敏度和分辨率高的轉基因棉花的PCR-DHPLC檢測方法。為實現上述目的，本專利技術采用了以下技術方案本專利技術公開了用于轉基因棉花的多重PCR-DHPLC檢測的引物，其特征在于所述弓I物包括弓I物對I，以及引物對2、引物對3和引物對4中的至少一對弓丨物；引物對I的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；引物對2的上游引物含有Seq ID No. 3所示序列，下游引物含有Seq IDNo. 4所示序列；引物對3的上游引物含有Seq ID No. 5所示序列，下游引物含有Seq ID No. 6所示序列；引物對4的上游引物含有Seq ID No. 7所不序列，下游引物含有Seq ID No. 8所不序列；Seq ID No. I :5，-TCCATGCCGCCTCACAAG-3’Seq ID No. 2 :5，-CCCAGCCCTCCAAAGATT-3’Seq ID No. 3 :5’ -TTGAAATTAAAAACCAATGCCAC-3，Seq ID No. 4 :5，-GATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3，Seq ID No. 5 :5，-AACGGGCGGAAACCCTTG-3’Seq ID No. 6 :5’ -GCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3，Seq ID No. 7 :5’ -TGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG-3’Seq ID No. 8 :5’ -GCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3’。需要指出的是，上述Seq ID No. I至Seq ID No. 8是與轉基因棉花的檢測靶標序列互補配對的特異序列，具有很強的特異性識別性。本專利技術中所述的用于轉基因大豆的PCR結合變性高效液相色譜技術檢測的引物，在本專利技術中作為一個不可分割的整體概念，由多對引物對混合而成，具體來說所述引物包括引物對1，以及選自引物對2-4的至少一對引物。其中，各引物對的特異性是本專利技術所述引物的基礎，但本專利技術所述引物的特異性等其它效果，更重要的還體現在其作為一個整體，其中的各引物對之間的理化特性以及PCR擴增產物之間的統一協調，這也是多重PCR擴增中弓I物組合配伍的關鍵與難點。進一步的，所述引物對1-4的上游引物的5’端還包括Seq ID No. 9所示序列，所述引物對1-4的下游引物的5’端還包括Seq ID No. 10所示序列；·Seq ID No. 9 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 10 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 9和Seq ID No. 10是分別在上游引物和下游引物的5 ’端添加的與檢測靶標序列無關的一段序列，該序列可以是與檢測靶標序列同源性很遠的其它物種的序列，也可以是一段隨機生成的序列。該序列可以用于調控PCR擴增產物的大小，以便于PCR擴增產物的進一步分析。本專利技術中，優選的，所述引物對I的上游引物具有Seq ID No. 11所示序列，下游引物具有Seq ID No. 12所示序列；引物對2的上游引物具有Seq ID No. 13所示序列，下游引物具有Seq ID No. 14所示序列；引物對3的上游引物具有SeqID No. 15所示序列，下游引物具有Seq ID No. 16所示序列；引物對4的上游引物具有Seq ID No. 17所示序列，下游引物具有Seq ID No. 18所不序列；Seq ID No. 11 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTCCATGCCGCCTCACAAG-3’Seq ID No. 12 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGACCCAGCCCTCCAAAGATT-3’Seq ID No. 13 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTTTGAAATTAAAA CCAATGCCAC-3，Seq ID No. 14 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3，Seq ID No. 15 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTAACGGGCGGAAACCCTTG-3’Seq ID No. 16 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3，Seq ID No. 17 :5’ -CGTGGCCTCGCGATCTGACTTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG—3’Seq ID No. 18 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3，。需要說明的是，所述Seq ID No. 11至Seq ID No. 18序列是由上述Seq IDNo. I至Seq ID No. 8序列分別在其5’端添加調控序列而成，盡管上述已經說明Seq ID No. 9和SeqID No. 10所示調控序列可以是隨機生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具體到本專利技術中，需要考慮調控序列與Seq ID No. I至Seq ID No. 8所示序列的理化性質的統一協調，并且還需要考慮添加調控序列后的Seq ID No. 11至Seq ID No. 18所示序列作為檢測引物的整體性能。本專利技術中，更優選的，所述引物對I為檢測棉花內源基因sad I基因的引物，引物對2為檢測轉基因棉花品系M0N531的引物，引物對3為檢測轉基因棉花品系M0N1445本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于轉基因棉花多重PCR?DHPLC檢測的引物，其特征在于：所述引物包括引物對1，以及引物對2、引物對3、引物對4中的至少一個；引物對1的上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.2所示序列；引物對2的上游引物含有Seq?ID?No.3所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.4所示序列；引物對3的上游引物含有Seq?ID?No.5所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.6所示序列；引物對4的上游引物含有Seq?ID?No.7所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.8所示序列；Seq?ID?No.1：5’?TCCATGCCGCCTCACAAG?3’Seq?ID?No.2：5’?CCCAGCCCTCCAAAGATT?3’Seq?ID?No.3：5’?TTGAAATTAAAAACCAATGCCAC?3’Seq?ID?No.4：5’?GATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT?3’Seq?ID?No.5：5’?AACGGGCGGAAACCCTTG?3’Seq?ID?No.6：5’?GCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC?3’Seq?ID?No.7：5’?TGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG?3’Seq?ID?No.8：5’?GCCGAACGCTGTTATCCTCAT?3’。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：章桂明，向才玉，凌杏園，潘廣，程穎慧，康林，李鶴遙，
申請(專利權)人：深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：