本發明專利技術公開了一種轉基因玉米的多重PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法，所述引物具有較強的特異性，能夠用于多重PCR擴增以及DHPLC分析。所述檢測方法提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度高的轉基因玉米檢測方法，實現了轉基因玉米的多靶標檢測。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，其片段大小區分率可達數個堿基，分辨率高。本發明專利技術的引物和檢測方法為轉基因玉米多靶標檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的高通量檢測方法，特別適合用于口岸檢驗檢疫等部門使用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種轉基因產品的檢測，特別是涉及一種轉基因玉米多重PCR-DHPLC檢測引物及檢測方法。
技術介紹
目前對轉基因玉米的檢測方法主要采用多重 PCR，多重實時熒光PCR、PCR-基因芯片等檢測方法。傳統的多重常規PCR檢測方法在平臺擴展方法具有一定的局限性，隨著待檢目標的增加，需要對體系中的每套引物的用量及比例重新進行優化，并且兼顧擴增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴增產物的方法，區分效率不高，檢測結果不理想。多重實時熒光PCR雖然在檢測靈敏度等方面較多重常規PCR檢測方法有優勢，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時提供互不干擾的4個熒光通道，也限制了該技術在檢測通量擴展。常規的多套PCR-基因芯片檢測方法，需要多套引物進行擴增，操作步驟繁瑣，并不適合大規模的高通量檢測。變性高效液相色譜技術(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有擴展性強、分辨率好、靈敏度高等優點。該方法在50°C條件下分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對的數量決定洗脫順序，當過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會根據分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與marker比較確定分子量大小，判定是否含有目標檢測基因。目前，尚沒有轉基因玉米的PCR結合DHPLC的檢測技術(PCR-DHPLC)。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于轉基因玉米多重PCR-DHPLC檢測的引物。本專利技術的另一目的是提供一種基于上述引物的擴展性能好、靈敏度和分辨率高的轉基因玉米多重PCR-DHPLC檢測方法。為實現上述目的，本專利技術采用了以下技術方案本專利技術公開了用于轉基因玉米多重PCR-DHPLC檢測的引物，所述引物包括引物對I、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6和引物對7中的至少一對弓丨物；引物對I的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；引物對2的上游引物含有Seq ID No. 3所示序列，下游引物含有Seq ID No. 4所示序列；引物對3的上游引物含有Seq ID No. 5所示序列，下游引物含有Seq ID No. 6所示序列；引物對4的上游引物含有Seq ID No. 7所示序列，下游引物含有Seq ID No. 8所示序列；引物對5的上游引物含有Seq ID No. 9所示序列，下游引物含有Seq ID No. 10所示序列；引物對6的上游引物含有Seq ID No. 11所示序列，下游引物含有Seq ID No. 12所示序列；引物對7的上游引物含有Seq ID No. 13所示序列，下游引物含有Seq ID No. 14所示序列。需要指出的是，上述Seq ID No. I至Seq ID No. 14是與轉基因玉米品系的檢測靶標序列互補配對的特異序列，具有很強的特異性識別性。進一步的，所述引物對3、引物對4、引物對5和引物對6，其上游引物的5’端還包括Seq ID No. 15所示序列，其下游引物的5’端還包括Seq ID No. 16所示序列；Seq ID No. 15 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 16 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 15和Seq ID No. 16是分別在上游引物和下游引物的5’端添加的與檢測靶標序列無關的一段序列，該序列可以是與檢測靶標序列同源性很遠的其它物種的序列，也可以是一段隨機生成的序列。該序列可以用于調控PCR擴增產物 的大小，以便于PCR擴增產物的進一步分析。本專利技術中，優選的，所述引物對3的上游引物具有Seq ID No. 17所示序列，下游引物具有Seq ID No. 18所示序列；引物對4的上游引物具有Seq ID No. 19所示序列，下游引物具有Seq ID No. 20所示序列；引物對5的上游引物具有Seq ID No. 21所示序列，下游引物具有Seq ID No. 22所示序列；引物對6的上游引物具有Seq ID No. 23所示序列，下游引物具有Seq ID No. 24所示序列。需要說明的是，所述Seq ID No. 17至Seq ID No. 24序列是由上述Seq ID No. 5至Seq ID No. 12序列分別在其5’端添加調控序列而成，盡管上述已經說明Seq ID No. 15和Seq ID No. 16所示調控序列可以是隨機生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具體到本專利技術中，需要考慮調控序列與Seq ID No. 5至Seq ID No. 12所示序列的理化性質的統一協調，并且還需要考慮添加調控序列后的Seq ID No. 17至Seq ID No. 24所示序列作為檢測引物的整體性能。本專利技術中，更優選的，所述引物對I為檢測轉基因玉米品系NK603的引物，引物對2為檢測轉基因玉米品系M0N863的引物，引物對3為檢測轉基因玉米品系M0N810的引物，弓丨物對4為檢測轉基因玉米品系T25的引物，引物對5為檢測轉基因玉米品系M0N88017的引物，引物對6為檢測轉基因玉米品系MIR604的引物，引物對7為檢測轉基因玉米品系59122的引物。本專利技術還公開了一種用于轉基因玉米多重PCR-DHPLC檢測方法，所述檢測方法包括采用上述引物，以玉米DNA為模板進行PCR擴增，并對PCR擴增產物進行變性高效液相色譜分析(Denaturing High-performance Liquid Chromatography, HPLC) 進一步的，所述檢測方法還包括以marker為參考標準進行變性高效液相色譜分析，將PCR擴增產物的變性高效液相色譜分析結果與marker的變性高效液相色譜分析結果進行比對。優選的上述檢測方法包括如下步驟(A)采用上述引物，以玉米DNA為模板，進行PCR擴增；(B)以步驟(A)的PCR擴增產物為樣品進行DHPLC分析，同時以marker為參考標準進行DHPLC分析；(C)將步驟(B)中樣品的DHPLC分析結果與marker的DHPLC分析結果進行比較，確定樣品的分子量大小，從而判斷是否含有檢測的靶標序列。由于采用以上技術方案，本專利技術的有益效果在于本專利技術的轉基因玉米多重檢測引物具有較強的特異性，能夠用于后續的多重PCR擴增以及DHPLC分析。本專利技術針對傳統的電泳分析PCR擴增結果不理想的問題，將PCR與DHPLC相結合，提供了一種操作簡便、擴展性能好、靈敏度和分辨率高的轉基因玉米多重檢測方法，實現了轉基因玉米的多靶標檢測。利用DHPLC對PCR擴增產物進行分析，對不同大小的PCR產物片段區分率可達數個堿基，甚至能夠區分出I個堿基大小差異的片段。本專利技術的引物和檢測方法為轉基因玉米品系BTll檢測提供了一種簡單、方便、有效、可靠的高通量檢測方法，特別適合用于口岸檢驗檢疫等部門使用。附圖說明圖為本專利技術實施例中DHPLC分析的部分結果，其中I轉基因玉米品系M0N863的洗脫峰、2為轉基因玉米品系NK603的洗脫峰、3為轉本文檔來自技高網...
【技術保護點】
用于轉基因玉米多重PCR?DHPLC檢測的引物，其特征在于：所述引物包括引物對1、引物對2、引物對3、引物對4、引物對5、引物對6和引物對7中的至少一對引物；引物對1的上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.2所示序列；引物對2的上游引物含有Seq?ID?No.3所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.4所示序列；引物對3的上游引物含有Seq?ID?No.5所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.6所示序列；引物對4的上游引物含有Seq?ID?No.7所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.8所示序列；引物對5的上游引物含有Seq?ID?No.9所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.10所示序列；引物對6的上游引物含有Seq?ID?No.11所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.12所示序列；引物對7的上游引物含有Seq?ID?No.13所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.14所示序列；Seq?ID?No.1：5’?TTATTTTGGACTATCCCGACTCTC?3’Seq?ID?No.2：5’?CTCAGCGGCGGAGCTACAGAGAGATAACAGGATCCACTCAAACAC?3’Seq?ID?No.3：5’?AACTATTGACCCTACTTGTTCGGAT?3’Seq?ID?No.4：5’?TCGGCAGAGGCATCTTGAAT?3’Seq?ID?No.5：5’?CGTCAACGTGCCCGGTACT?3’Seq?ID?No.6：5’?AAAGGACCTGACTGCTCGCA?3’Seq?ID?No.7：5’?GGCAGCTACGACATGATACTCCT?3’Seq?ID?No.8：5’?CCGAGGAGGTTTCCGGATATTA?3’Seq?ID?No.9：5’?TTTTCTGTACTTGTGTAATCGGCTAA?3’Seq?ID?No.10：5’?AGTTGACCATCCAAACCCGA?3’Seq?ID?No.11：5’?TCTGCGCACGCAATTCAAC?3’Seq?ID?No.12：5’?CGTTGTGGTCTCCATCCTCTTAC?3’Seq?ID?No.13：5’?AAGCGAACGATTCAGATGGC?3’Seq?ID?No.14：5’?CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA?3’。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：章桂明，向才玉，凌杏園，潘廣，程穎慧，康林，李鶴遙，
申請(專利權)人：深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，
類型：發明
國別省市：
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