轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻PCR-DHPLC檢測(cè)引物及檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，所述引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于多重PCR擴(kuò)增以及DHPLC分析。所述檢測(cè)方法提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測(cè)方法。利用DHPLC對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，其片段大小區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，分辨率高。本發(fā)明專利技術(shù)的引物和檢測(cè)方法為轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測(cè)提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測(cè)方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部門使用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻品系的PCR-DHPLC檢測(cè)弓I物及檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
目前對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)方法主要采用常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR-基因芯片等檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的常規(guī)PCR檢測(cè)方法在平臺(tái)擴(kuò)展方面具有一定的局限性，隨著待檢目標(biāo)的增加，需要對(duì)體系中的每套引物的用量及比例重新進(jìn)行優(yōu)化，并且兼顧擴(kuò)增效率等因素，工作量較大；另一方面，通常采用的凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，區(qū)分效率不高，檢測(cè)結(jié)果不理想。實(shí)時(shí)熒光PCR雖然在檢測(cè)靈敏度等方面較多重常規(guī)PCR檢測(cè)方法有優(yōu)勢(shì)，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時(shí)提供互不干擾的4個(gè)熒光通道，也限制了該技術(shù)在檢測(cè)通量擴(kuò)展。常規(guī)的多套PCR-基因芯片檢測(cè)方法，操作步驟繁瑣，并不適·合大規(guī)模的高通量檢測(cè)。變性高效液相色譜技術(shù)(Denaturing High-performance LiquidChromatography, DHPLC)是一種簡單、快速、非凝膠的核酸分析方法，具有擴(kuò)展性強(qiáng)、分辨率好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該方法在50°C條件下分析樣品，樣品峰的洗脫只由堿基對(duì)的數(shù)量決定洗脫順序，當(dāng)過柱的乙腈濃度提高，核酸片段會(huì)根據(jù)分子量從小到大的順序被洗脫出來。通過得到的洗脫峰與marker比較確定分子量大小，判定是否含有目標(biāo)檢測(cè)基因。目前，尚沒有轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR結(jié)合DHPLC的檢測(cè)技術(shù)(PCR-DHPLC)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物。本專利技術(shù)的另一目的是提供一種基于上述引物的擴(kuò)展性能好、靈敏度和分辨率高的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用了以下技術(shù)方案本專利技術(shù)公開了用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，所述引物的上游引物含有Seq ID No. I所示序列，下游引物含有Seq ID No. 2所示序列；Seq ID No. I :5，-CTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’Seq ID No. 2 :5’ -AGGCGGTGAAGGGCAATC-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2是與轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的檢測(cè)靶標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的特異序列，具有很強(qiáng)的特異性識(shí)別性。進(jìn)一步的，所述上游引物的5’端還包括Seq ID No. 3所示序列，所述下游引物的5’端還包括Seq ID No. 4所示序列；Seq ID No. 3 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’Seq ID No. 4 :5，-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3，。需要指出的是，上述Seq ID No. 3和Seq ID No. 4是分別在上游引物和下游引物的5 ’端添加的與檢測(cè)靶標(biāo)序列無關(guān)的一段序列，該序列可以是與檢測(cè)靶標(biāo)序列同源性很遠(yuǎn)的其它物種的序列，也可以是一段隨機(jī)生成的序列。該序列可以用于調(diào)控PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，以便于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的進(jìn)一步分析。本專利技術(shù)中，優(yōu)選的，所述上游引物具有Seq ID No. 5所示序列，下游引物具有SeqID No. 6所示序列； Seq ID No. 5 :5，-CGTGGCCTCGCGATCTGACTCTTTTCTGGCTGTCTCGGCT-3’Seq ID No. 6 :5，_CTCAGCGGCGGAGCTACAGAAGGCGGTGAAGGGCAATC_3，。需要說明的是，所述Seq ID No. 5和Seq ID No. 6序列是由上述Seq ID No. I和Seq ID No. 2序列分別在其5’端添加調(diào)控序列而成，盡管上述已經(jīng)說明Seq ID No. 3和SeqID No. 4所示調(diào)控序列可以是隨機(jī)生成的序列，但是，并不是任意序列都可以添加，具體到本專利技術(shù)中，需要考慮調(diào)控序列與Seq ID No. I和Seq ID No. 2所示序列的理化性質(zhì)的統(tǒng)一協(xié)調(diào)，并且還需要考慮添加調(diào)控序列后的Seq ID No. 3和Seq ID No. 4所示序列作為檢測(cè)引物的整體性能。本專利技術(shù)還公開了一種用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括采用上述引物，以水稻DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。進(jìn)一步的,所述檢測(cè)方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效液相色譜分析結(jié)果與marker的變性高效液相色譜分析結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。優(yōu)選的上述檢測(cè)方法包括如下步驟(A)采用所述引物，以水稻DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(B)以步驟(A)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為樣品進(jìn)行DHPLC分析，同時(shí)以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DHPLC分析；(C)將步驟⑶中樣品的DHPLC分析結(jié)果與marker的DHPLC分析結(jié)果進(jìn)行比較，確定樣品的分子量大小，從而判斷是否含有檢測(cè)的靶標(biāo)序列。由于采用以上技術(shù)方案，本專利技術(shù)的有益效果在于本專利技術(shù)的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測(cè)引物具有較強(qiáng)的特異性，能夠用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增以及DHPLC分析。本專利技術(shù)針對(duì)傳統(tǒng)的電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果不理想的問題，將PCR與DHPLC相結(jié)合，提供了一種操作簡便、擴(kuò)展性能好、靈敏度和靈敏度高的轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測(cè)方法。利用DHPLC對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，對(duì)不同大小的PCR產(chǎn)物片段區(qū)分率可達(dá)數(shù)個(gè)堿基，甚至能夠區(qū)分出I個(gè)堿基大小差異的片段。本專利技術(shù)的引物和檢測(cè)方法為轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻檢測(cè)提供了一種簡單、方便、有效、可靠的檢測(cè)方法，特別適合用于口岸檢驗(yàn)檢疫等部11使用。附圖說明圖為本專利技術(shù)實(shí)施例中DHPLC分析的部分結(jié)果；圖中自上而下的曲線分別標(biāo)記為M、l-15，M為marker、l為非轉(zhuǎn)基因水稻DNA、2為Bt63DNA、3為轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻1DNA、4為轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)DNA、5為轉(zhuǎn)基因玉米M0N88017DNA、6為轉(zhuǎn)基因玉米品系Btl76DNA、7為轉(zhuǎn)基因玉米BtllDNA、8為轉(zhuǎn)基因玉米M0N863DNA、9為大豆品系A(chǔ)2704-12DNA、10為大豆品系A(chǔ)5547_12DNA、11為非轉(zhuǎn)基因油菜DNA、12為轉(zhuǎn)基因棉花LLcotton25DNAU3為非轉(zhuǎn)基因棉花DNA、14為土豆EH92-527-1DNA、15為水對(duì)照。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)公布了用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測(cè)的引物，該引物針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的特異序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。進(jìn)一步的，還在引物的上游和下游分別添加了一段與檢測(cè)靶標(biāo)序列無關(guān)或者同源性很遠(yuǎn)的調(diào)控序列，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小的調(diào)控。需要指出的是，所述調(diào)控序列的加入只是為了獲得更優(yōu)異的檢測(cè)效果，因此，本專利技術(shù)優(yōu)選的，用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR結(jié)合DHPLC技術(shù)檢測(cè)的引物是加入了調(diào)控序列的引物，分別具有Seq ID No. 5至Seq ID No. 6所示序列。本專利技術(shù)還公開了一種用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻的PCR-DHPLC檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括采用所述引物，以水稻DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性高效液相色譜分析。進(jìn)一步的，所述檢測(cè)方法還包括以marker為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行變性高效液相色譜分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性高效本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
用于轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻PCR?DHPLC檢測(cè)的引物，其特征在于：所述引物的上游引物含有Seq?ID?No.1所示序列，下游引物含有Seq?ID?No.2所示序列；Seq?ID?No.1：5’?CTTTTCTGGCTGTCTCGGCT?3’Seq?ID?No.2：5’?AGGCGGTGAAGGGCAATC?3’。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：章桂明，向才玉，凌杏園，潘廣，程穎慧，康林，李鶴遙，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：