本發明專利技術屬于轉基因動物中轉基因成分的分子檢測技術領域，具體涉及提供一種適用于轉人抗凝血酶Ⅲ基因山羊的快速簡便檢測方法，本發明專利技術利用環介導等溫擴增法原理，準確快速檢測出轉基因山羊中的人抗凝血酶Ⅲ基因。本發明專利技術不需要特殊設備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本發明專利技術的方法同時也為轉基因生物及其產品安全評價和管理提供了實用的分子檢測方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于轉基因成分的檢測
，具體涉及一種適用于轉人抗凝血酶III基因山羊的轉基因成分的快速簡便檢測方法。
技術介紹
轉基因生物的安全評價是轉基因生物及其產品市場化和商品化的前提，在安全評價中轉基因成分的檢測是一項重要內容，建立轉基因生物快速、簡便、準確的檢測方法為安全評價和管理奠定基礎。人抗凝血酶(MT)，也有人稱為人抗凝血酶III (hATIII)，是肝臟產生的凝血系統中最重要的抗凝因子。在正常生理狀態下，它可以阻止凝血的發生，維持血 液的正常流動；當血管受損時，又能限制血凝塊的擴大，防止血液堵塞。(楊海.人抗凝血酶III的cDNA克隆、表達、純化及其重組蛋白對DIC大鼠模型的療效研究.·陜西楊凌西北科技農林大學，2009.) 2009年7月，青島森淼生物技術有限公司與青島森淼生物技術研究所所承擔的國家863計劃所生產的利用乳腺生物反應器生產的抗凝血酶III蛋白純品研究成果通過國家級項目評估，標志著我國血液蛋白抗凝血酶III的生產將擺脫對血源的依賴(傳統方式是從人體血液中提取)。鑒于轉人抗凝血酶III基因山羊生產技術的成熟以及其產品市場化的趨勢，因此建立一種快速、簡便的檢測人抗凝血酶III基因的方法，具有必要性和緊迫性。綜合目前各國對轉基因產品的檢測技術，根據檢測目標，可將其分為以下三個水平插入的外源基因的檢測；插入外源基因的表達產物(RNA或者蛋白質)的檢測；插入的外源基因對受體生物基因表達的影響(外源基因的插入對位點附近的基因的影響從而對整個生物體的代謝的影響)的研究，而其中核酸水平的檢測應用更為廣泛。核酸水平的檢測，主要采用的方法是PCR擴增，即依據轉入外源基因的啟動子、目的基因、終止子及表達(重組)載體信息，設計特異性引物，進行聚合酶鏈式反應，依據產物的有無或多少判斷是否為轉基因產品。PCR檢測轉基因產品，通常涉及以下技術定性PCR、定量PCR、巢式PCR、多重PCR、熱不對稱交錯PCR等。PCR反應具有高靈敏度、高特異性、高效性的特點，是轉基因產品初篩階段的主要檢測方法，需要進行PCR擴增和電泳檢測兩個環節，但必須依賴PCR儀等精密儀器，檢測費用高，對檢測人員有較高的技術要求，無法在條件較差的基層實驗室進行。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的局限性，提供適用于轉人抗凝血酶III基因山羊的快速簡便檢測方法，利用環介導等溫擴增法原理建立外源基因的快速檢測方法，能準確快速檢測出轉基因山羊中人抗凝血酶III基因。本專利技術不需要特殊設備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本專利技術的方法同時也為轉基因生物及其產品安全評價和管理提供借鑒。實現本專利技術的技術方案如下(I)引物設計及合成根據人抗凝血酶III基因(hATIII)的基因(GenBank:X68793)序列設計特異性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP 5/ -GCATGTGGACCACCACGATCA-CCAGAGGTGCTGCAAGAG-3/ ；BIP 5/ -CGCTTCCGCATTGAGGACGG-TCGACAAGGCCCATGTCTT-3/ ；F3 5/ -GGCCAAGGTAGAGAAGGAAC-3'；B3 5/ -GGACTTTTCAGGGCTGAACA-3'；(2)環介導等溫擴增反應以FIP、BIP為內引物，F3、B3為外引物對人抗凝血酶III基因進行恒溫擴增，其 反應體系為IM 甜菜堿，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ 3mM,4. 8U Bst DNA聚合酶，I μ I模板，外引物F3和Β3各O. 24 μ Μ，內引物FIP和BIP各I. 56 μ Μ，補雙蒸水至25 μ 1，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200 μ I EP管中，于90°C反應5min，反應后立即冰浴l_2min，再加入4. 8U Bst DNA聚合酶，于59°C反應60min，80°C下反應5min后終止反應;(3)環介導恒溫擴增產物分析I)瓊脂糖凝膠電泳取2. 5 μ I擴增產物，加入I μ I上樣緩沖液(濃度為40 %的甘油，O. 2%溴酚藍，59. 8% O. 25Μ Tris-HCl)，混勻，再于2%瓊脂糖凝膠中電泳30min,得到凝膠成像，觀察是否有階梯型條帶，若有階梯型條帶則判定為含有人抗凝血酶III基因(即含有轉基因成分)，若沒有階梯型條帶則判定為不含人抗凝血酶III基因。2)熒光染料染色將SYBR Green I熒光染料稀釋100倍(按體積計)后作為工作液，取5μ I的環介導等溫擴增產物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼觀察結果。若加入SYBR Green I工作液后，擴增產物變為黃綠色，則判定為含有人抗凝血酶III基因，若加入SYBR Green I工作液后，擴增產物為棕黃色則判定為不含人抗凝血酶III基因。本專利技術成功建立了對人抗凝血酶III基因的快速、靈敏、特異而又簡單實用的檢測方法。與其它傳統PCR方法相比該專利技術有以下優點I.本專利技術經濟實用反應是在恒溫的條件下進行，所以不需要昂貴的PCR儀，只需要一臺可以提供恒溫的設備，例如水浴鍋即可。2.本專利技術的靈敏度高采用本方法可以檢測下限至10個拷貝的人抗凝血酶III基因，比普通的PCR的靈敏度高10倍。3.本專利技術的特異性強本專利技術采用設計了 4條引物，可識別6個特異性區域，增加了與目的基因結合的特異性。4.本專利技術的檢出率高對5頭轉人抗凝血酶III基因山羊進行檢測，均檢測出轉基因成分，檢出率為100%，對15個人的DNA樣品進行了 LAMP擴增，結果表示，檢出率為100%。5.本專利技術檢測簡單直接肉眼觀察反應產物經SYBR Green I染色后的顏色變化來定性判斷靶序列擴增與否。附圖說明序列表SEQ ID NO :1是擴增的人抗凝血酶III基因的部分核苷酸序列，長度為172bp。序列表SEQ ID NO :2_5分別是設計的引物序列(引物的序列編號依次為FIP ；BIP ；F3 和 B3)。圖I :本專利技術擴增的人抗凝血酶III基因的特異片段，片段全長為172bp，線條標記部分為引物所處位置，序列中方框所示位置為限制性內切酶Eco471識別位點。圖2 :PCR擴增人抗凝血酶III基因電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ;1_15 :模板為人基因組DNA ；16 :模板為非轉基因山羊；17 :水。 圖3 =LAMP擴增人抗凝血酶III基因電泳圖，圖中M DL2000 DNA marker ;1_15 模板為人基因組DNA ；16 :模板為非轉基因山羊基因組DNA ；17 :水。圖4 :LAMP擴增人抗凝血酶III基因可視化結果，圖中1_15 :模板為人基因組DNA ；16 :模板為非轉基因山羊基因組DNA; 17 :水。圖5 :LAMP擴增人抗凝血酶III基因產物酶切組成圖，圖中方框所示部分為酶切后產物組成。圖6 =LAMP擴增人抗凝血酶III基因產物酶切驗證電泳圖，圖中M DL2000 DNAmarker ；1 :酶切后的LAMP擴增產物。圖7 pMD18T-hATIII的結構圖，圖中顯示插入了 hATIII (人抗凝血酶III)基因片段。圖8 :LAMP與PCR擴本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種適用于轉人抗凝血酶III基因山羊的快速、簡便檢測方法，其步驟包括：(1)引物設計及合成：根據人抗凝血酶III基因序列設計特異性引物，所述引物的DNA序列如下所示：FIP：5’?GCATGTGGACCACCACGATCA?CCAGAGGTGCTGCAAGAG?3’；BIP：5’?CGCTTCCGCATTGAGGACGG?TCGACAAGGCCCATGTCTT?3’；F3：5’?GGCCAAGGTAGAGAAGGAAC?3’；B3：5’?GGACTTTTCAGGGCTGAACA?3’；(2)環介導等溫擴增反應：以FIP、BIP為內引物，F3、B3為外引物對人抗凝血酶III基因進行恒溫擴增，其反應體系為：1M甜菜堿，400μM?dNTPs，2.5μl?10×Bst?Buffer，Mg2+?3mM，4.8U?Bst?DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.24μM，內引物FIP和BIP各1.56μM，補雙蒸水至25μl，將上述除酶以外的所有試劑混勻置于200μl?EP管中，于90℃反應5min，反應后立即冰浴1?2min，再加入4.8U?Bst?DNA聚合酶，于59℃反應60min，80℃下反應5min后終止反應；(3)環介導恒溫擴增產物檢測：1)瓊脂糖凝膠電泳：取2μl擴增產物，加入1μl上樣緩沖液，該緩沖液包含濃度為40％的甘油、0.2％溴酚藍和59.8％0.25M?Tris?HCl，混勻，再按質量體積計加2％瓊脂糖凝膠，于5V/cm下電泳30min，得到凝膠成像，觀察是否有梯形條帶出現；2)將SYBR?Green?I熒光染料按體積計稀釋100倍后作為工作液，取5μl的環介導等溫擴增產物，再加0.5μlSYBR?Green?I的工作液，在日光下用肉眼觀察結果。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉榜，翟珊莉，陶晨雨，張慶德，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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