本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)非編碼小RNA的方法，寡核苷酸序列探針在末端轉(zhuǎn)移酶作用下3’末端標(biāo)記非同位素；將已標(biāo)記探針和樣品RNA置于液相雜交環(huán)境充分反應(yīng)使樣品中目的非編碼小RNA和探針形成雜化雙鏈。之后將雜交產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離結(jié)合為雙鏈的RNA-探針和未雜交的過量探針，之后在轉(zhuǎn)移至尼龍膜，經(jīng)紫外線交聯(lián)固定，加入鏈霉親和素-HRP即可顯色發(fā)光。在體系中，雜交后的目的RNA-探針與單一未雜交探針均能通過鏈霉親和素-HRP，加入酶底物發(fā)出熒光條帶，在X線光片顯影。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測(cè)非編碼小RNA的方法，尤其涉及一種應(yīng)用非同位素標(biāo)記探針液相雜交檢測(cè)非編碼小RNA的方法。
技術(shù)介紹
非編碼小RAN (small non-messenger RNA,本專利技術(shù)也稱為小RNA)是細(xì)胞中一大類由幾十核苷酸到幾百核苷酸組成的、不編碼蛋白質(zhì)的RNA，如核小RNA、核仁RNA、微RNA、干擾小RNA、時(shí)序小RNA等，這類RNA本身或與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體有重要的生物學(xué)功能，研究發(fā)現(xiàn)，小RNA在生物體內(nèi)細(xì)胞、組織等的發(fā)育、生長(zhǎng)、分化、甚至疾病的發(fā)生以及病毒的入侵和防御方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前可用于檢測(cè)小RNA的技術(shù)主要有Northern blot、RT-PCR及微陣列芯片技術(shù)。PCR技術(shù)如《實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)小RNA》(中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32 (3)359 360)公開的定量檢測(cè)小RNA的方法，微陣列芯片技術(shù)如CN101182576A公開的用于胃組織的微RNA探針和以及檢測(cè)微RNA的方法。盡管RT-PCR、微陣列技術(shù)檢在測(cè)小RNA時(shí)與Northern blot技術(shù)相比較具有較高靈敏度,但是傳統(tǒng)的Northern blot方法不僅可以直接檢出待測(cè)的RNA，而且能明確RNA的堿基數(shù)目，同時(shí)也可進(jìn)行半定量測(cè)定，所以傳統(tǒng)的Northern blot仍是檢測(cè)非編碼小RNA的金標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用傳統(tǒng)的Northern blot技術(shù)檢測(cè)非編碼小RNA包括變性聚丙烯酰胺膠分離小RNA片段、將小RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素膜、預(yù)雜交、同位素探針雜交、檢測(cè)等。整個(gè)過程步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，需要2-3天才能完成；更為重要的是檢測(cè)過程中應(yīng)用到同位素，這需要特定的操作場(chǎng)所、儀器設(shè)備及相關(guān)專業(yè)人員，這些不足大大限制了其推廣及應(yīng)用。因此有人應(yīng)用非同位素標(biāo)記探針(生物素標(biāo)記探針)來(lái)替代同位素標(biāo)記的探針，雖然避免了同位素不利的方面，但是繁瑣的操作過程并未減少，檢測(cè)信號(hào)的時(shí)間仍未縮短。眾所周知，RNA酶無(wú)處不在，繁瑣的操作增加了小RNA被RNA酶降解的風(fēng)險(xiǎn)，不可避免降低了傳統(tǒng)Northernblot技術(shù)檢測(cè)小RNA的敏感性，尤其加大了對(duì)低豐度非編碼小RNA檢測(cè)的難度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了克服傳統(tǒng)Northern blot技術(shù)在檢測(cè)非編碼小RNA方面的不足，拓展Northern blot技術(shù)在檢測(cè)非編碼小RNA方面的應(yīng)用，本專利技術(shù)創(chuàng)造提供一種新型的優(yōu)化方案，該技術(shù)不僅能有效檢測(cè)出小RNA，而且還能簡(jiǎn)便、快速、安全以及準(zhǔn)確的進(jìn)行定量分析待測(cè)非編碼小RNA。本專利技術(shù)提供的檢測(cè)非編碼小RNA的方法，步驟包括步驟1，在寡核苷酸探針的3’末端標(biāo)記非同位素；步驟2，將已標(biāo)記非同位素的探針與樣品RNA置于液體雜交環(huán)境中，使非編碼小RNA和所述探針進(jìn)行液相雜交形成雜化雙鏈，分離所述雜化雙鏈；步驟3，定量或定性檢測(cè)所述小RNA。其中，所述定量或定性檢測(cè)均可采用非變性聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選為15%非變性聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)。本專利技術(shù)上述檢測(cè)非編碼小RNA方法中，步驟I中所述非同位素優(yōu)選為生物素。使用所述生物素進(jìn)行寡核苷酸探針標(biāo)記的方法可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施，如酶學(xué)法、化學(xué)法、光化學(xué)法等等。本專利技術(shù)上述的檢測(cè)非編碼小RNA方法中，分離得到所述雜化雙鏈之后,加入HRP偶聯(lián)酶親和素使所述雜化雙鏈顯色，具體地，先將所述雜化雙鏈轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外線交聯(lián)固定，然后加入所述HRP偶聯(lián)鏈酶親和素(以下也稱為“鏈霉親和素-HRP”)。本專利技術(shù)上述的檢測(cè)非編碼小RNA方法中，步驟I中所述寡核苷酸探針為待測(cè)小RNA的互補(bǔ)序列。本專利技術(shù)上述的檢測(cè)非編碼小RNA方法中，所述液體雜交環(huán)境包括雜交緩沖液，所述雜交緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。其中憐酸鹽緩沖液組分30mmol/L phosphate buffer>0. 3mmol/L NaCl>lOmmol/LEDTA ；Tris-HCl 緩沖液組分100mM Tris-HCl( pH 值 8.5) 、500nM KCl、15mM MgCl2,l%Tritox-100，或者 IOOmM Tris-HCl (pH 值 7· 5)、IM NaClUOmM EDTA0本專利技術(shù)上述的檢測(cè)非編碼小RNA方法中，所述液相雜交可以采用PCR儀或水浴進(jìn)行退火。其中，使用所述PCR儀退火方法為PCR儀上逐步降溫，先90°C、2min，然后每90s降溫1°C，直至溫度將至25°C ;所述水浴退火條件為95°C水浴5min，然后置于42°C、2 3小時(shí)。本專利技術(shù)上述的檢測(cè)非編碼小RNA方法，可以用于定量檢測(cè)小RNA含量，分析電泳檢測(cè)雜化雙鏈條帶灰度值和未雜交探針條帶灰度值，所述小RNA含量計(jì)算公式為雜化馭鏈條帶灰度値權(quán)利要求1.一種檢測(cè)非編碼小RNA的方法，其特征在于，步驟包括步驟1，在寡核苷酸探針的3’末端標(biāo)記非同位素；步驟2，將已標(biāo)記非同位素的探針與樣品RNA置于液體雜交環(huán)境中，使非編碼小RNA和所述探針進(jìn)行液相雜交形成雜化雙鏈，分離所述雜化雙鏈；步驟3，定量或定性檢測(cè)所述小RNA。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2中所述液相雜交，采用PCR儀或水浴進(jìn)行退火。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述液體雜交環(huán)境包括雜交緩沖液，所述雜交緩沖液為磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述非同位素為生物素。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，分離所述雜化雙鏈后，先將所述雜化雙鏈轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外線交聯(lián)固定，加入所述HRP偶聯(lián)鏈酶親和素使所述雜化雙鏈顯色，然后進(jìn)行步驟4。6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，步驟I中所述寡核苷酸探針為待測(cè)小RNA的互補(bǔ)序列。7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，定量檢測(cè)所述小RNA方法為分析電泳檢測(cè)雜化雙鏈條帶灰度值和未雜交探針條帶灰度值，其中，使步驟2中所述探針足量，所述小RNA含量計(jì)算公式為8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述定量或定性檢測(cè)采用非變性聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。9.一種如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法在檢測(cè)非編碼小RNA中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述非編碼小RNA為miRNA。全文摘要本專利技術(shù)提供了一種檢測(cè)非編碼小RNA的方法，寡核苷酸序列探針在末端轉(zhuǎn)移酶作用下3’末端標(biāo)記非同位素；將已標(biāo)記探針和樣品RNA置于液相雜交環(huán)境充分反應(yīng)使樣品中目的非編碼小RNA和探針形成雜化雙鏈。之后將雜交產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離結(jié)合為雙鏈的RNA-探針和未雜交的過量探針，之后在轉(zhuǎn)移至尼龍膜，經(jīng)紫外線交聯(lián)固定，加入鏈霉親和素-HRP即可顯色發(fā)光。在體系中，雜交后的目的RNA-探針與單一未雜交探針均能通過鏈霉親和素-HRP，加入酶底物發(fā)出熒光條帶，在X線光片顯影。文檔編號(hào)G01N27/447GK102952848SQ20111023525公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月17日專利技術(shù)者高豐厚, 郭躍輝, 姜斌 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測(cè)非編碼小RNA的方法，其特征在于，步驟包括：步驟1，在寡核苷酸探針的3’末端標(biāo)記非同位素；步驟2，將已標(biāo)記非同位素的探針與樣品RNA置于液體雜交環(huán)境中，使非編碼小RNA和所述探針進(jìn)行液相雜交形成雜化雙鏈，分離所述雜化雙鏈；步驟3，定量或定性檢測(cè)所述小RNA。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高豐厚，郭躍輝，姜斌，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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