用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物、試劑盒和方法技術

本發(fā)明專利技術涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ?ID?No.1-5所示。本發(fā)明專利技術還涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD檢測試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明專利技術所述的引物。本發(fā)明專利技術還涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法，所述方法包括使用本發(fā)明專利技術所述的引物或試劑盒。本發(fā)明專利技術還涉及本發(fā)明專利技術所述的引物或試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。使用本發(fā)明專利技術的RAPD方法，能夠快速進行啤酒大麥品種和/或純度的檢測，且操作簡便，結果可靠。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體而言，本專利技術涉及用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物、用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的試劑盒、使用所述引物或試劑盒檢測啤酒大麥品種和/或純度的方法，以及所述引物或試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。
技術介紹
大麥是僅次于水稻、小麥、玉米等糧食作物的第四大主產(chǎn)作物，根據(jù)其用途可分為啤酒大麥、飼用大麥、食用大麥三種類型。其中啤酒大麥是啤酒釀造的主要來源。目前我國啤酒大麥種植面積約1000萬畝，年產(chǎn)約150-200萬噸，優(yōu)質啤酒大麥產(chǎn)量遠遠達不到市場需求，據(jù)統(tǒng)計1998-2007年我國從澳大利亞、加拿大、法國共計進口 1834. I萬噸啤酒大麥，年均進口量183萬噸。近年來，由于啤酒工業(yè)的迅猛發(fā)展，對啤酒大麥的需求不斷增大，同 時對其品質要求也隨之提高。啤酒大麥種質的優(yōu)劣將直接影響麥芽和啤酒品質。因各地風土氣候和耕種習慣等原因，世界各地不同品系、不同產(chǎn)地的啤酒大麥各不相同，釀造出的啤酒質量也大相徑庭。啤酒大麥品種和/或純度是評判啤酒大麥質量的重要指標，準確鑒別啤酒大麥品種和/或純度是啤酒大麥原料質量控制的重要措施。目前，由于生產(chǎn)、經(jīng)營、管理不規(guī)范，不合格種子甚至假種頻繁混入市場，對啤酒工業(yè)造成了一定損失，并損害了品種權擁有者的利益和廣大農(nóng)民的經(jīng)濟利益，破壞了良好的市場秩序。因此，建立一套完善的種質鑒定體系尤為重要。目前，傳統(tǒng)的鑒定手段多采用形態(tài)標記方法，如穗長、粒色、干粒重等，但該法易受環(huán)境及雜交過程個體變化影響，鑒定結果不可靠。在啤酒大麥種質鑒定方面尋求可靠的分子生物學技術成為一種趨勢。RAPD (隨機擴增多態(tài)DNA)技術作為一種DNA分子指紋技術，是利用合成的隨機引物基于整個基因組序列進行隨機PCR擴增，不同的基因組由于序列的差異導致PCR產(chǎn)物長度多態(tài)性，通過電泳檢測到的多態(tài)性特征對不同基因組進行區(qū)分，十分容易發(fā)現(xiàn)不同樣品之間的序列差異。因此，RAPD在物種鑒定中的優(yōu)勢非常突出，不僅操作相對簡便，容易標準化，而且是從基因水平進行分析，不受外界條件的影響，分辨率高，可有效區(qū)分近緣品種。目前，國內外對于檢測啤酒大麥的品種和/或純度的RAPD方法研究較少，而且技術尚不夠成熟，尤其是對于啤酒大麥的純度檢測尚無直接根據(jù)擴增條帶進行半定量的先例。另外，傳統(tǒng)的啤酒大麥RAro檢測技術是通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物的檢測，例如“侯永翠等，利用RAPD標記分析大麥種質資源的遺傳多樣性,《植物遺傳資源學報》2005,6 (2) 145 150”和“張大樂等，中國啤酒大麥品種RAPD標記的遺傳多樣性分析，《武漢植物學研究》2005，23(4) 305 309”中所揭示的，通過肉眼觀察分子量標準對應位置來判斷標記條帶的有無，容易受到電泳條件變化或操作誤差造成的條帶位置偏差的干擾，加上隨機擴增自身的非特異性，得到的圖譜往往在重現(xiàn)性上存在問題。另外，目前針對啤酒大麥之類的谷物純度的基因鑒別方法主要采用單粒法，操作繁瑣，需要投入大量人力物力。因此，本領域需要一種快速、簡便以及可靠的啤酒大麥品種和/或純度的檢測方法。
技術實現(xiàn)思路
一方面，本專利技術提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物，所述引物的核苷酸序列為SEQ ID No. 1-5所示。 本專利技術所述引物的核苷酸序列分別為SEQ ID No. I(Opp14) :5，CCAGCCGAAC3，；SEQ ID No. 2 (BA8) :5，GTCCACACGG3，；SEQ ID No. 3 (BAlO) :5，CTGCTGGGAC3，；SEQ ID No. 4(BA152) :5，TTATCGCCCC3，;以及SEQ ID No. 5(BA187) :5，TCCGATGCTG3，。另一方面，本專利技術提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD試劑盒，所述試劑盒包含本專利技術所述的引物。根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，本專利技術的所述試劑盒還包含使用說明書，所述使用說明書中記載的隨機PCR擴增反應條件是94°C, IOmin ；94°C lmin, 37°C lmin, 72°C 2min，45個循環(huán)；72°C 5min。根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，本專利技術的所述試劑盒還包含用于提取樣品DNA的試劑和用于隨機PCR擴增反應的試劑。根據(jù)一種進一步優(yōu)選的實施方式，所述試劑盒還包含標準品和陰性對照，所述標準品為啤酒大麥目標品系的DNA序列，所述陰性對照為無菌雙蒸水。再一方面，本專利技術提供了用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法，所述方法包括使用本專利技術所述的引物或試劑盒。根據(jù)一種實施方式，本專利技術用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法包括如下步驟；(I)提取啤酒大麥DNA模板；(2)分別使用本專利技術所述的引物對于所述步驟⑴獲得的啤酒大麥DNA模板進行隨機PCR擴增；(3)對所述步驟(2)隨機PCR擴增獲得的產(chǎn)物進行毛細管芯片電泳；(4)根據(jù)所述步驟(3)獲得的標志帶圖譜鑒定啤酒大麥的品種；和/或(5)對于所述步驟(3)獲得的標志帶圖譜繪制標準曲線，建立啤酒大麥純度檢測半定量模型，以判定啤酒大麥目標品種的純度。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，其中，上述步驟(2)的隨機PCR擴增的條件被設定為94°C, IOmin ；94°C lmin,37°C lmin,72°C 2min，45 個循環(huán)；72°C 5min。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，本專利技術用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的RAPD方法能夠鑒定選自下述的啤酒大麥品種甘啤3號、甘啤4號、懇啤2號、懇啤3號、Harningtan,Copeland、Metcalfe、Baudlin、Hamel in Λ Legacy、Kendall、Stirling、Gairdner Λ Estevel、Cervoise、Flagship、Arturio、Vlamingh 以及 Newdale。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，其中，上述步驟(3)中毛細管芯片電泳釆用50_1000bp分子量標準品。又一方面，本專利技術提供了本專利技術所述的引物或試劑盒在檢測啤酒大麥品種和/或純度中的應用。本專利技術RAPD技術通過使用本專利技術人篩選的5條隨機寡核苷酸引物并利用毛細管芯片電泳對PCR產(chǎn)物高分辨、高靈敏度、穩(wěn)定以及準確量化(分子量、相對量以及濃度)的優(yōu)點，對初選得到的隨機擴增標志帶的重現(xiàn)性進行嚴格篩查，最終得到7條有意義的標志帶。結果證明，利用本專利技術建立的RAro檢測方法可以有效地進行啤酒大麥品種的鑒定，同時還通過標準曲線方法建立啤酒大麥純度快速檢測半定量模型，從而可對啤酒大麥樣品純度進行準確的半定量檢測。該半定量方法直接對混合樣品進行檢測，無需對大量的單粒種子分別進行鑒別，可以迅速判斷樣品的純度范圍，使得操作更為簡便。本專利技術的RAPD技術快速、簡便且可靠，具有良好的應用推廣前景。附圖說明·圖I顯示不同擴增酶反應體系對7個標志帶的靈敏度影響情況。這里使用的擴增酶反應體系包括Hotstar、Takara> Invitrogen。靈敏度表示為模板的10倍倍比系列稀釋倍數(shù)，倍數(shù)越高，說明靈敏度越高。橫坐標為標志帶，縱坐標為稀釋倍數(shù)。圖2是19號和I號組合(圖2A)、14號和3號組合(圖2B)、11號和8號組合(圖2C)的啤酒大麥不同比例混合物(基于I號、1本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
用于檢測啤酒大麥品種和/或純度的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為SEQ?ID?No.1?5所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：吳亞君，陳穎，王斌，韓建勛，袁飛，
申請(專利權)人：中國檢驗檢疫科學研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：