一種利用腫瘤靶向性細菌激活前藥的方法及其應用技術

本發明專利技術屬生物技術領域，具體涉及一種利用腫瘤靶向性細菌激活前藥的方法及其應用，該方法利用腫瘤靶向性細菌作為一種天然的前藥激活工具，腫瘤靶向性細菌能夠組成型地表達內源性的前藥激活酶基因，從而能夠在腫瘤組織特異性地激活前藥，產生抗腫瘤效果，該方法能夠用于腫瘤的治療。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬生物
，具體涉及一種利用腫瘤靶向性細菌激活前藥的方法及其應用。
技術介紹
特異性地殺傷腫瘤細胞而避免傷害機體正常細胞的腫瘤靶向治療一直是腫瘤治療研究的一個重要方向和熱點。基因介導的酶前藥治療(Gene-Directed Enzyme ProdrugTherapy, GDEPT)做為腫瘤靶向性治療的一種重要手段在多種腫瘤動物模型或臨床上顯示了良好的治療效率。目前已開發的酶/前藥治療系統主要有單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)、胞嘧啶脫氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)、嘌呤核苷酸磷酸酶/6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷(PNP/6MePdR)等等。這些可用于激活前藥的酶主要來自于細菌或病毒，而不表達于正常哺乳動物細胞。人們利用病毒載體、細菌載體、抗體將激活前藥的酶特 異性運輸到腫瘤組織，使前藥激活酶在腫瘤細胞或組織中特異性表達，這樣注射前藥以后，前藥就特異性地在腫瘤組織內轉化為有殺傷活性的藥，而避免對正常機體的傷害(Xu G等，2001，Clin Cancer Res. 7(11) :3314-3324)。但是依賴于表達載體的GDEPT治療存在以下缺點腫瘤靶向性不佳、腫瘤細胞轉染效率不足、體內穩定性不好、造價昂貴等。嘌呤核苷酸磷酸酶/6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷(PNP/6MePdR)系統是由Sorscher EJ等于1994年開發，它利用大腸桿菌PNP基因(嘌呤核苷酸磷酸酶)可以轉化腺苷(脫氧腺苷)為腺嘌呤和核糖一磷酸(脫氧核糖一磷酸)，而正常哺乳動物細胞的嘌呤核苷酸磷酸酶沒有該活性，不能催化腺苷(脫氧腺苷)的裂解(Sorscher EJ等，1994年，Gene Ther 1:233-238)。PNP/6MePdR系統具有廣譜的抗腫瘤效果，學者們利用各種靶向性載體試圖實現PNP基因在腫瘤高效靶向的表達，但是仍然面臨著上述依賴于載體的酶前藥治療的各種技術難題。一些兼性厭氧細菌如沙門氏菌、梭狀芽孢桿菌等能夠特異性的在腫瘤壞死區復制、生長、代謝和繁殖，具有較高的腫瘤靶向性。這些細菌加以減毒改造后，被廣泛的用于腫瘤治療或腫瘤基因治療的運輸載體。2002年美國I期臨床顯示單一劑量的靜脈注射減毒沙門氏菌沒有顯示良好的抗腫瘤效果(Toso JF等，2002，J Clin Oncol 20 :142-152.)，因此單一的腫瘤細菌治療仍然存在著療效不顯著等問題，急需開發一種新的策略和系統以增強腫瘤細菌治療的療效，減少副作用。
技術實現思路
本專利技術的目的就是針對以上存在的問題和不足，解決上述前藥和細菌治療中存在的各種技術難題，建立實現在腫瘤組織中高效特異性地富集前藥激活酶，開發一種具有良好的治療效率，且操作簡單，成本低廉的腫瘤靶向性細菌/前藥激活方法。為了達到上述目的，本專利技術提供了一種利用腫瘤靶向性細菌激活前藥的方法，其特征是將腫瘤靶向性細菌作為一種天然的前藥激活工具，所述的腫瘤靶向性細菌可以為減毒鼠傷寒沙門氏菌或其它具有腫瘤靶向性能的細菌；所述的前藥可以為6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷^MePdR)或其他可以被細菌轉化為活性抗腫瘤藥的化合物。進一步地，本專利技術提供了一種本身具有前藥激活活性的腫瘤靶向性細菌，其特征是不經過任何基因改造或外源基因的過表達，而是利用細菌自身內源性的組成性表達于細菌胞內、周質、內膜或外膜的具有前藥轉化活性的酶來實現對前藥的激活。進一步地， 本專利技術提供了一種由細菌自身表達的細菌前藥激活酶基因，其特征是不經過任何基因改造或外源基因的過表達，而是利用細菌自身內源性的組成性表達于細菌內、來實現前藥的轉化和激活。該類細菌前藥激活酶基因在細菌中高度保守，該類可以是嘌呤核苷酸磷酸酶基因、胞嘧啶脫氨酶基因、胸苷激酶基因。進一步地，本專利技術提供了一種細菌介導的前藥激活方法，其特征在于將細菌作為前藥轉化的工具，而且所述的細菌還必須具有好的腫瘤靶向能力。進一步地，本專利技術提供了一種前藥激活方法，其特征是利用細菌自身的前藥激活酶基因作為前藥的轉化工作，該類前藥可以是丙氧鳥苷(GCV)、5_氟胞嘧啶(5-FC)、6_甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷^MePdR)。進一步地，以減毒鼠傷寒沙門氏菌激活6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷^MePdR)前藥為例，減毒鼠傷寒沙門氏菌可以將前藥6MePdR轉化為高效的抗腫瘤藥6-甲基嘌呤(6MeP)，在小鼠黑色素瘤模型中，腫瘤倍數生長時間由6MePdR組的5. 54天，細菌組的8. 72天，增加到6MePdR/細菌組的19. 58天。與現有的前藥激活方法或細菌治療策略相比，本專利技術的創新和特殊之處在于(I)專利技術了一種腫瘤靶向性細菌/前藥激活方法，其利用腫瘤靶向性細菌及其自身內源的前藥激活基因來激活前藥，并在小鼠黑色素瘤模型上，細菌/前藥組腫瘤抑制率顯著高于單一的細菌組和單一的前藥給藥組。(2)專利技術了一種前藥細菌激活方式，該方式直接利用細菌來轉化前藥，利用該方式可以實現在腫瘤組織特異性地激活前藥。(3)專利技術了一種細菌/前藥聯合應用的治療策略，利用該策略可以大大提高細菌抗腫瘤效率。綜上所述，本專利技術建立了一種全新的腫瘤治療方法，該方法將腫瘤靶向性細菌與前藥聯合，利用富集于腫瘤組織的細菌直接激活前藥，而不需要在細菌中引入或者過表達外源性的前藥激活基因，獲得良好的治療效果。四附圖說明圖I、減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009腫瘤靶向性分析由于肝臟和脾臟是細菌分布最多的正常組織，因此檢測細菌在肝臟、脾臟和腫瘤組織中的滴度(***P < O. 001) :I、腫瘤；2、脾臟；3、肝臟。圖2、減毒鼠傷寒沙門氏菌前藥激活活性分析(2A)鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌PNP基因序列分析與同源性比較。(2B)PNP基因在鼠傷寒沙門氏菌VNP20009和大腸桿菌ToplO中的表達1、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 ;2、大腸桿菌ToplO。(2C)注射細菌后，PNP基因在各組織中的表達I、脾臟；2、肝臟；3、腫瘤；4、肺；5、腎臟。圖3、減毒鼠傷寒沙門氏菌激活前藥分析HPLC分析鼠傷寒沙門氏菌VNP20009和大腸桿菌ToplO的前藥激活活性1、前藥底物 6MePdR標準品；2、活性產物 6MeP 標準品；3、ToplO+6MePdR ;4、VNP20009+6MePdR ;5、大腸桿菌ToplO ;6、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009。圖4、細菌/前藥抗腫瘤效率分析(4A)給藥2周后，腫瘤大小I、PBS對照；2、前藥6MePdR ;3、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 ;4、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009+前藥6MePdR。(4B)腫瘤生長曲線(**P < O. 01，***P < O. 001) :1、PBS 對照；2、前藥 6MePdR ;3、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 ;4、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009+前藥6MePdR。·(4C)腫瘤倍數生長時間，即從IOOOmm3到2000mm3所需要的天數(*P < O. 05，***P<O. 001) :1、PBS對照;2、前藥6MePdR;3、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 ;4、鼠傷寒沙門氏菌VNP20009+ 前藥 6MePdR。(4D)腫瘤延遲時間，即腫瘤長到IOOOmm3所需要的天數0*P 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種利用腫瘤靶向性細菌激活前藥的方法，其特征是將腫瘤靶向性細菌作為一種天然的前藥激活工具，所述的腫瘤靶向性細菌是具有腫瘤靶向性能的細菌；所述的前藥為被前藥激活酶轉化為抗腫瘤活性藥的化合物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：華子春，陳果，
申請(專利權)人：南京大學，
類型：發明
國別省市：