用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b?GNs偶聯復合物及其制備方法技術

用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b?GNs偶聯復合物及其制備方法，屬于生物醫藥技術領域，將金納米殼溶液和mPEG?SH?2000混合進行反應，制得PEG修飾的金納米殼，再以DEPC水為溶劑，將PEG修飾的金納米殼和siRap2b混合進行反應，制得siRap2b?GNs偶聯復合物。本發明專利技術選用中空金納米殼做為藥物載體，偶聯有siRap2b后可用于惡性腫瘤的靶向治療。本發明專利技術以Rap2b為靶標，利用GNs具有金納米粒子的所有優點，能夠將藥物穩定高效地定向輸送至腫瘤組織，實現對腫瘤細胞的高效殺傷，從而大大提高了腫瘤治療效果。

For malignant tumor targeting siRap2b GNs coupling compound and its preparation method of treatment

For malignant tumor targeting siRap2b GNs coupling compound and a preparation method of treatment, which belongs to the technical field of biological medicine, nano gold shell solution and mPEG SH 2000 mixed reaction of gold nanoshells prepared PEG modified by DEPC, water as solvent, the PEG modified gold shell and siRap2b meters the reaction mixture was prepared from siRap2b, GNs coupling compound. The invention adopts the hollow gold nano shell as a drug carrier and can be used for the targeted treatment of malignant tumors after being coupled with siRap2b. The present invention uses Rap2b as the target, all the advantages of using GNs with gold nanoparticles, drug can be stable and efficient directional transport to the tumor tissue, to achieve efficient killing of tumor cells, thereby greatly improving the effectiveness of cancer treatment.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫藥
，旨在制備一種新型制劑，用于腫瘤治療，分類號為A61P。
技術介紹
癌癥，即惡性腫瘤，是一類嚴重威脅人類健康的疾病。據國際癌癥研究署（IARC）發布的最新數據顯示，全球每年有800多萬人死于癌癥，到2020年全球每年新增癌癥患者將超過1700萬，我國癌癥年新發病例將由2012年的300萬增長到近400萬，因此研制高效的抗腫瘤制劑、制定更加有效的腫瘤治療方案是目前急需解決的問題之一。惡性腫瘤的形成與多種因素有關，其中腫瘤抑制基因p53及其信號通路的異常在腫瘤的發生發展過程中起著非常重要的作用。據報道，大約有50%的人類腫瘤都有p53基因的突變，而在p53沒有突變的腫瘤中，與p53活化有關的途徑大多都被破壞，從而導致p53失活。因此，多年來，p53一直是腫瘤研究的重點，而p53信號通路分子也是腫瘤治療的重要靶點之一。經研究發現，p53的新靶基因Rap2b具有促進腫瘤細胞生存的功能，降低Rap2b的胞內表達水平能顯著提高阿霉素殺傷腫瘤細胞的效果，由此可以認為Rap2b與腫瘤細胞產生對阿霉素的耐藥性有關。進一步研究發現，Rap2b在進化上高度保守，并在約80%腫瘤組織中呈現高表達。因此，理論上Rap2b可以作為一種重要靶點用于腫瘤的治療，通過小分子干擾RNA（siRNA）降低Rap2b的胞內表達水平能顯著提高阿霉素對腫瘤細胞的殺傷效果。靶向制劑是目前腫瘤醫學研究的熱點，它能夠將抗腫瘤藥物最大限度地輸送到靶器官，盡量降低藥物在正常組織中的分布，從而達到高效低毒的治療效果。近年來，基于納米技術的靶向給藥系統廣泛應用于癌癥的診療。粒徑在10-1000nm的納米藥物由于小尺寸效應而具有巨大的表面能，因此屬于熱力學不穩定體系和動力學穩定體系。這使它們具有許多不同于體相材料的優異的磁學、光電、光熱等性質。此外，在腫瘤靶向治療應用中，這些納米粒子的最重要特質就是對實體瘤的高通透性和滯留效應——EPR效應，即相對于正常組織，納米粒子具有更趨向于聚集在腫瘤組織的性質。正常組織中的微血管內皮間隙致密、結構完整，大分子和脂質顆粒以及納米粒子不易透過血管壁，而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差，淋巴回流缺失，造成納米粒子具有選擇性的高通透性和滯留性。這種現象使得納米粒子所裝載的藥物能夠靶向釋藥至腫瘤組織，并在高效殺傷腫瘤細胞的同時，降低對正常機體組織的毒性。在體內環境下利用siRNA進行基因治療的主要難點在于體內大量存在的RNA酶對外源RNA干擾序列的降解，因此開發能抑制RNA降解的合適藥物載體對于改善siRNA在體內環境中的穩定性從而提高療效具有重要意義。當前快速發展的納米材料技術則為解決這一問題提供了一條重要思路。在各種納米材料中，納米金是常用的基因藥物載體之一。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b-GNs偶聯復合物。本專利技術用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b-GNs偶聯復合物的特征在于：在PEG修飾的金納米殼上偶聯siRap2b。研究表明，金納米粒子能夠與供電基團（如巰基、氨基等）形成穩定的化學鍵。這一特性確保了金納米粒子容易通過化學修飾連接多種藥物。例如，基因類藥物（如siRNA等）以較高的密度通過巰金鍵修飾在金納米粒子四周時，納米粒子表面的空間構象導致的空間位阻伴隨著高密度核酸外殼的電子云形成了一種微環境，這種微環境能夠抑制循環系統中RNA酶對siRNA的降解作用，從而保證了siRNA在體內環境下的穩定性。本專利技術選用中空金納米殼做為藥物載體，偶聯有siRap2b后可用于惡性腫瘤的靶向治療。本專利技術以Rap2b為靶標，利用GNs具有金納米粒子的所有優點，能夠將藥物（siRap2b）穩定高效地定向輸送至腫瘤組織，實現對腫瘤細胞的高效殺傷，從而大大提高了腫瘤治療效果。本專利技術還提供了以上偶聯復合物的制備方法。用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b-GNs偶聯復合物的制備方法包括以下步驟：1）將金納米殼溶液和mPEG-SH-2000混合進行反應，制得PEG修飾的金納米殼；2）以DEPC水為溶劑，將PEG修飾的金納米殼和siRap2b混合進行反應，制得siRap2b-GNs偶聯復合物。本專利技術在步驟1）中先采用PEG修飾GNs，可以提高納米粒子的穩定性。在步驟2）中將siRap2b與PEG修飾的GNs溶液混合進行反應，使siRap2b的5’端巰基與GNs形成配位鍵。以此構成了在PEG修飾的GNs上偶聯siRap2b的目的。本專利技術工藝具有操作步驟少、生產周期短、生產成本低、操作條件溫和、偶聯效率高、副產物少、無污染、產品的分離純化簡單等優點。本專利技術制備的Adr-GNs偶聯復合物和siRap2b-GNs偶聯復合物的聯合使用對體外培養的腫瘤細胞表現出明顯的殺傷作用，并明顯抑制荷瘤小鼠體內腫瘤的生長，經將Adr-GNs偶聯復合物和siRap2b-GNs偶聯復合物與光照配合治療后，腫瘤大小為生理鹽水對照組的1/14，為單獨使用Adr-GNs偶聯復合物的對照組的1/8，為使用Adr-GNs偶聯復合物與光照對照組的1/2.6。附圖說明圖1為制備取得的金納米殼的電鏡照片。圖2為GNs、Adr-GNs偶聯復合物和siRap2b-GNs偶聯復合物的吸收光譜圖。圖3為金納米殼（GNs）在波長為808nm、功率為2w?cm-2的激光照射下的光熱效應圖。圖4為每小時照射1min的Adr-GNs偶聯復合物釋藥率與時間的關系圖。圖5為每小時照射1min的siRap2b-GNs偶聯復合物釋藥率與時間的關系圖。圖6為激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細胞HCT116對Adr-GNs偶聯復合物和siRap2b-GNs偶聯復合物攝取的熒光對比圖。圖7為各藥物對腫瘤細胞HCT116存活率的影響對比圖。圖8為各試驗組對HCT116結腸癌治療前后腫瘤體積的變化對比圖。圖9為各試驗組對HCT116結腸癌治療前后小鼠體重的變化對比圖。圖10為各試驗組對HCT116結腸癌治療結束后的腫瘤實物大小對比照片。具體實施方式1、金納米殼（GNs）的制備：參照文獻報道的方法（JianYou,GuodongZhang,andChunLi.Exceptionallyhighpayloadofdoxorubicininhollowgoldnanospheresfornear-infraredlight-triggereddrugrelease.ACSNano,2010.4(2):1033-1041.），將3.4mgAgNO3和15mg二水合檸檬酸三鈉溶于100mL去離子水，邊攪拌邊加入7.6mgNaBH4，加熱至60℃并攪拌2h。冷卻至室溫，加入83.4mg鹽酸羥胺，攪拌5min，再加入29.75mgAgNO3，攪拌2h以上（最好過夜）。然后再將溶液加熱至60℃，并快速加入1mL濃度為20mg/mL的氯金酸水溶液，于60℃攪拌1h后停止反應。4℃靜置48h，棄去底部沉渣。上層溶液即為GNs，置于4℃環境中保存備用。按Prevo等報道的方法（BrianG.Prevo,ShelleyA.Esakoff,AlexanderMikhailovsky,andJosephA.Zasadzinski.Scalableroutestog本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b?GNs偶聯復合物，其特征在于：在PEG修飾的金納米殼上偶聯siRap2b。

【技術特征摘要】
1.用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b-GNs偶聯復合物，其特征在于：在PEG修飾的金納米殼上偶聯siRap2b。2.如權利要求1所述用于惡性腫瘤靶向治療的siRap2b-GNs偶聯復合物的制備方法，其特征在于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張新躍，丁笠，孫若男，
申請(專利權)人：揚州大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32