一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法技術

本發(fā)明專利技術涉及一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，以固定有振蕩破碎管架的機械振蕩器，提供振蕩破碎動力，將生物樣本、振蕩破碎珠和有機溶劑裝至振蕩破碎管內，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在一定的振蕩轉速或頻率下，利用管內振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機溶劑的滲透溶解，實現(xiàn)生物樣本組織或細胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明專利技術兼具處理樣本通量大、過程簡單、工作效率高、實驗系統(tǒng)誤差小，所需樣品和溶劑少、勞動強度低、且隔絕溶劑揮發(fā)等優(yōu)點。在工業(yè)微生物、動物和植物優(yōu)良品種選育及工藝優(yōu)化過程中，應用本發(fā)明專利技術可以有效的提高樣品的處理通量和胡蘿卜素提取效率。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及類胡蘿卜素生產及研究
，具體地說，是一種通過利用固定于高速振蕩器上的振蕩架，將多組裝有有機溶劑，振蕩破碎珠和待提取樣品的封閉破碎管進行同時振蕩。借助于振蕩破碎珠的碰撞碾磨效應以及有機溶劑的萃取效應，從而將各破碎管中細胞內所含的類胡蘿卜素同時進行溶解抽提，從而實現(xiàn)分析樣本的類胡蘿卜素高通量快速提取。
技術介紹
胡蘿卜素(Carotene)最早由Wackenroder在1831年從胡蘿卜中分離出，β-胡蘿 卜素的分子式由Willstather在1906年測定，而結構式在1928年-1932年為Zechmeister等確定。胡蘿卜素是一種橙色的光合色素，廣泛存在于綠色和黃色蔬菜以及水果中，使其帶有橙色，并在光合作用中扮演傳遞能量的角色。胡蘿卜素屬于屬四萜類化合物。在其分子的兩端各有一個紫蘿酮環(huán)，中心斷裂可產生兩個維生素Α，是視黃醇(維生素Α)的二聚物且擁有多種結構，最主要的兩種是α-胡蘿卜素與β-胡蘿卜素，此外還有Υ-胡蘿卜素、δ -胡蘿卜素與ε -胡蘿卜素三種。β-胡蘿卜素分子式是C4tlH56，分子量約536. 88。由于該化合物分子中具有長的共軛雙鍵生色基團，因而具有光吸收的性質，使其顯黃色，在紫外光譜中有三個吸收峰(455nm, 483nm和340nm)。β -胡蘿卜素主要有全反式，9-順式，13-順式及15-順式四種形式，其中天然的β_胡蘿卜素主要是全反式異構體和少量順式異構體。這主要是因為在順式結構中，雙鍵附近的氫原子之間或氫原子和甲基基團之間會產生較大的空間位阻，而造成順式結構的不穩(wěn)定。9-順式-β-胡蘿卜素在疏水溶劑中溶解容易，結晶困難，通常以油狀物出現(xiàn)，而全反式-β -胡蘿卜素結晶較為容易。β -胡蘿卜素無臭無味，稀溶液呈橙黃色至黃色，濃度增大時帶橙色，因溶劑極性不同可能稍帶紅色。β_胡蘿卜素的結晶為暗紅紫色六角棱晶或暗紅色菱形片晶。在真空中的熔點為184°C，由于它的分子結構中不存在不對稱碳原子，因而不具備旋光性。β-胡蘿卜素易溶于二硫化碳、二氯甲烷、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、丙酮、石油醚、己烷和植物油，不溶于水，難溶于醚、丙二醇、甘油、丙二醇、甲醇、乙醇、酸和堿。其在橄欖油和苯中的溶解度均為O. lg/mL，在氯仿中的溶解度為43g/l，高濃度時呈橙紅色，低濃度時呈橙色至黃色。β -胡蘿卜素在PH值2 7的范圍內較穩(wěn)定，且不受還原性物質的影響，但對光和氧均不穩(wěn)定，易在光照和加熱時發(fā)生氧化反應。鐵離子會促使其褪色。自1831年Wzckenerler首次成功分離胡蘿卜素以來，世界上科學家們對胡蘿卜素的研究一直沒有停止過。近年來，有關β_胡蘿卜素對人體作用的研究異常活躍。β_胡蘿卜素有維生素A源之稱，是一種重要的人體生理功能活性物質，其在肝臟中可以轉變成維生素Α，是維生素A合成的前體。盡管β-胡蘿卜素的生物活性機制尚未完全了解，Blumberg在1994年柏林召開的第二屆抗氧化劑維生素在預防疾病中的作用的國際會議時已經提出，β_胡蘿卜素至少有以下幾方面的功能(I) β _胡蘿卜素是維生素A的前體，而維生素A是人體必需的微量營養(yǎng)成分；(2)具有免疫功能，能提高人體免疫系統(tǒng)抵抗病原物的能力；(3)具有抗氧化劑的功能，能夠淬滅單線態(tài)氧，清除體內自由基的影響；(4)能預防癌癥，延緩癌癥的發(fā)展；(5)促進細胞縫間連接交流。目前，胡蘿卜素在抗炎、解毒、抗癌、預防心血管疾病、防治白內障和保護肝臟方面的生理作用也已被越來越多地證實，并應用于疾病的預防和治療。最近一項通過對4000多名內科醫(yī)師長達18年的研究表明，長期隔日服用50mg的β-胡蘿卜素可以有效的防治男性大腦意識的衰退。此外，β -胡蘿卜素還可以作為著色和抗氧化添加劑應用于醫(yī)藥、食品、化妝品和動物飼料等行業(yè)。β -胡蘿卜素根據生產方式不同分為化學合成β -胡蘿卜素和天然β _胡蘿卜素兩大類。其中包括β-胡蘿卜素在內的類胡蘿卜素廣泛存在于生物界中，包括植物、動物、 藻類和微生物等，它們是天然類胡蘿卜素的豐富來源。雖然天然β_胡蘿卜素生產成本較高，但由于不存在致癌物質，水溶性較好，具有良好的生理活性，且常常與其他類胡蘿卜素等抗氧化天然活性產物復合在一起，因此具有很好的抗哮喘、抗染色體畸變和防癌等藥理活性。天然β-胡蘿卜素目前已被國際癌癥研究中心及美國國家癌癥研究所認可，并經聯(lián)合國糧農組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)批準為A類營養(yǎng)食品添加劑。隨著人們對天然營養(yǎng)和保健產品認識的不斷提高，以及食品安全問題的日益重視(尤其是近年來違法使用瘦肉精、吊白塊、蘇丹紅、三聚氰胺、梓檬黃和鄰苯二甲酸酯等人工色素和食品添加劑現(xiàn)象的曝光)，天然色素及安全的食品添加劑(例如，天然色素β-胡蘿卜素等)將逐步在市場中占據主導地位。目前，天然β _胡蘿卜素主要可通過植物提取、鹽藻法和微生物發(fā)酵三種方法生產。其中，微生物發(fā)酵法具有生產穩(wěn)定，受季節(jié)、氣候、時間和地域因素影響小，生產周期較短，質量控制相對比較容易等優(yōu)勢。另外，通過發(fā)酵規(guī)模的放大，也較為容易滿足目前對天然類胡蘿卜素日益增長的市場需求。鑒于以上特點，研究人員對天然分離得到的產β_胡蘿卜素微生物進行了系統(tǒng)的比較和研究，并通過誘變篩選和發(fā)酵研究，發(fā)現(xiàn)了一些極有應用價值的工業(yè)微生物菌株。無論何種來源的天然β-胡蘿卜素，其工業(yè)生產菌株、藻種以及各類動植物皆經過長期的誘變、雜交、基因工程改造以及篩選工作，從而使得生物來源的組織細胞，能夠在工業(yè)生產過程中大量積累β_胡蘿卜素，以降低生產成本并獲得符合預期的市場利潤。在以上工業(yè)菌株(包括各類微生物、藻種、動植物及相應的細胞系)選育過程中，對培養(yǎng)得到的生物體組織細胞中的β-胡蘿卜素進行提取和分析，是目前表征生物體組織細胞生產及積累β_胡蘿卜素能力高低的唯一和必須手段。根據以往文獻報道，對各類生物體組織細胞進行破碎并對細胞中的β _胡蘿卜素進行提取的方法主要分為物理法和化學法。其原理為借助于各類溶劑體系，直接滲入細胞5中提取(例如，超臨界流體)或借助各類物理或化學過程使細胞破裂甚至粉碎后，對細胞內的β-胡蘿卜素進行溶解萃取。孫景茂專利技術《一種從胡蘿卜中提取天然β胡蘿卜素的工藝》(公開號CN1092063 ； 公開日1994.09. 14)。它以干燥的胡蘿卜為原料，以沸點低于80°C，室溫下為液體的有機溶劑為提取劑，以胡蘿卜重量與溶劑體積之比為1 I. 5 5，浸取溫度為室溫，經過罐組逆流浸出器提取，刮板式薄膜蒸發(fā)器蒸發(fā)濃縮，結晶，洗滌，重結晶，干燥可得含80 % 90%的β-胡蘿卜素晶體。中國科學院武漢病毒研究所的陳濤等人專利技術了《一種三孢布拉氏霉菌中胡蘿卜素的提取方法》(公開號CN1221737 ;公開日1999. 07. 07)所述方法是采用低沸點的石油系有機溶劑萃取菌中的胡蘿卜素。萃取溶劑與菌體積比為I 10 : 1，溫度為40°C 70°C， 每次為O. 5小時 I小時,萃取二次,并合并萃取液。西格弗里德·彼得等人專利技術了《從含有胡蘿卜素的原料中提取胡蘿卜素的方法》(國際公布W099. 58611英；公開日1999· 11. 18 ;公開號CN1297469 ;公開日2001.05.30)。該方法主要從含有胡蘿卜素的原料中、特別是從生物學來源的脂本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高通量提取生物樣本中胡蘿卜素的方法，其特征在于，以固定有振蕩破碎管架的機械振蕩器，提供振蕩破碎動力，將生物樣本、振蕩破碎珠和有機溶劑裝至振蕩破碎管內，并將密封的振蕩破碎管鎖定于振蕩器管架上，在一定的振蕩轉速或頻率下，利用管內振蕩破碎珠的碰撞摩擦及有機溶劑的滲透溶解，實現(xiàn)生物樣本組織或細胞的研磨破碎以及胡蘿卜素樣本的溶解提取。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：董宏偉，徐大剛，吳向陽，蔡楊，陳慧芳，楊曄，吳欣森，李泓全，童海寶，
申請(專利權)人：上海化工研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：