本發明專利技術公開了一種適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品制備的方法。以蚯蚓為試材，于液氮中快速研磨，制得蚯蚓干粉。向蚯蚓干粉中加入以丙酮為溶劑的10%（w/v）的三氯乙酸，之后將-20℃下預冷的以丙酮為溶劑的10%（w/v）的三氯乙酸與所得沉淀充分混合，洗滌沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物。最后加入樣品裂解液充分混合，離心取上清，制得適合雙向電泳的高質量的蚯蚓總蛋白樣品。本發明專利技術制備蚯蚓總蛋白雙向電泳樣品的方法可獲得分辨率高、重復性好的雙向電泳圖譜，便于后續的生物質譜分析鑒定蛋白，為蚯蚓蛋白組學研究提供重要技術支撐。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及。
技術介紹
蚯蚓在生態系統中具有重要的功能，能疏松土壤，增加土壤有機質并改善土壤結構，還能促進酸性或堿性土壤變為中性土壤，增加磷等速效成分，使土壤適于農作物的生長，促進農業增產。蚯蚓是土壤污染的敏感指示物，對多種重金屬、有機農藥、多氯聯苯、多環芳烴、放射性污染物等環境有害物質有反應指示和積累指示的特殊作用。利用蚯蚓的分子、生物化學和生理反應(生物標志物)監測土壤污染情況現已備受關注。目前，國內外利用蚯蚓指示污染物對土壤生態系統造成的影響主要通過實地調查污染土壤中蚯蚓種群數量及種群結構；或是在實驗室條件下，通過毒性和繁殖試驗研究污染物對某一種類蚯蚓造成的傷害，即蚯蚓的生態毒理學研究。而從分子生物學，尤其是蛋白質組學方面的研究尚且較少。蛋白質組學分析是研究蚯蚓蛋白的自身變化及周圍環境刺激響應的重要技術手段。其中雙向電泳技術是在蛋白質水平上研究基因表達產物最有效的方法之一。選擇合適的樣品制備方法是雙向電泳成功的關鍵因素之一，樣品的制備直接影響到分離結果的有效性、可靠性及可重復性。由于蚯蚓中雜質成分復雜，如色素、多糖和核酸等都會嚴重干擾雙向電泳，因此目前還沒有制備適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品的分析研究，從而導致蚯蚓相關的蛋白質組研究滯后。
技術實現思路
為了解決上述問題，本專利技術利用土壤中的蚯蚓為試材，通過對蛋白質樣品制備步驟的大量摸索，建立了一套適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品制備體系，為蚯蚓的蛋白質組學研究提供技術保障。本專利技術的技術方案包括以下步驟I)取吐泥Id后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨時間為5_15min ；2)按蚯蚓干粉質量與以丙酮為溶劑的溶液A的體積之比為I :10的比例，向蚯蚓干粉中加入適量溶液A充分混合，-20°C靜置8_12h，得到蚯蚓總蛋白樣品；所述以丙酮為溶劑的溶液A中的溶質為0. 01-0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇、10%(w/v)的三氯乙酸；3)步驟2)中所得的蚯蚓總蛋白樣品離心20-30min :4°C，轉速12000_15000g，棄上清液；用_20°C下預冷的以丙酮為溶劑的溶液A洗滌沉淀，-20°C靜置l_2h，棄上清液；使用溶液A洗滌沉淀3次以上，直至上清液為無色透明為止，棄上清液，收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物；4)收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物；5)將步驟4)中得到的蚯蚓總蛋白粗提物溶解于裂解緩沖液中振蕩混合l_2min后冰浴冷卻lmin，如此重復振蕩混合l_2h。裂解緩沖液包括9. 8mol/L尿素(urea)，4%(w/V)的3-丙磺酸內鹽(CHAPS)，65mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)，2%(v/v)的膠條緩沖液(IPG buffer)，1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF)。所述裂解緩沖液與蚯蚓總蛋白樣品的質量體積比為O. 04g/400 μ L-O. 05g/400 μ L ；6)將步驟5)中混合液離心取上清液得到適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品。使用的樣品裂解液中，尿素作為變性劑能破壞蛋白質的高級結構，打斷非共價鍵鏈接。CHAPS是一 種兼性去污劑，能打斷蛋白質分子或亞基間的疏水作用，增加蛋白質的溶解性。加入DTT是為了打斷二硫鍵，并使所有蛋白質處于還原狀態。PMSF是一種蛋白酶抑制劑，能有效抑制絲氨酸蛋白酶以及巰基蛋白酶的活性，防止目標蛋白的降解。所使用的膠條緩沖液能通過電荷間的相互作用減少蛋白質結合，從而增加蛋白質可溶性。本專利技術的有益效果在于采用三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白質，并且增加蛋白清洗次數，可以有效去除鹽離子、多糖、脂類、核酸等干擾電泳的物質。本專利技術的方法簡單易行，進行雙向電泳分析獲得了重復性好、分辨率高的電泳圖譜。便于后續的質譜分析鑒定，具有較大的實際應用價值。附圖說明圖I為蚯蚓總蛋白樣品雙向電泳圖譜具體實施例方式以下實例中未詳盡描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。應理解以下實施例只是為了舉例說明本專利技術，而非以任何形式限制本專利技術的范圍。實施例II.樣品制備I)取吐泥Id后的3條性成熟赤子愛勝蚓于液氮中快速研磨10min(液氮添加量以能凍住蚯蚓并可研磨成蚯蚓干粉末為準)，將研磨后的粉末轉移至5ml離心管中，O. 2g/管；每管加入2mL以丙酮為溶劑的溶液A (溶質為0. 01-0. 03mmol/L的二硫蘇糖醇、10% (w/v)的三氯乙酸)，充分漩渦混合，-20°C靜置IOh ;靜置后的蚯蚓總蛋白樣品離心30min :4°C，轉速12000g，棄上清液；將_201下預冷的以丙酮為溶劑的溶液A與所得沉淀充分混合，洗滌沉淀，-20°C靜置l_2h，棄上清液；洗滌步驟重復3次以上，直至上清液為無色透明為止；收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物。2)將上述所得的蚯蚓總蛋白粗提物溶解于裂解緩沖液中(裂解液包括9. Smol/L尿素,4% (w/v)的3-丙磺酸內鹽，65mmol/L 二硫蘇糖醇，2%(v/v)膠條緩沖液(IPGbuffer), 1%(w/v)的苯甲基磺酰氟(PMSF)),所用裂解液與Φ丘蝴總蛋白樣品的體積質量比為O. 045g/400 μ L0振蕩混合Imin后冰浴冷卻lmin,如此重復振蕩混合2h ;所得混合液離心60min :15°C，轉速14000g ;取上清液得到適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品；-20°C保存備用。2.雙向電泳檢測I)水化上樣吸取50μ L蚯蚓總蛋白樣品，加入到260μ L的水化液中，充分混合，混合液離心IOmin: 15°C，轉速10000r/min;取離心后所得的350 μ L上清液，加入到IPG膠條泡漲盤中，將ΡΗ4-7，18cm的膠條膠面朝下放入泡漲盤中，保證膠面與樣品液之間無氣泡產生。膠條與水化液充分接觸O. 5h后，加l_2mL覆蓋油，20°C水化10_12h。水化液包括8mol/L尿素，2% (w/v)的3_丙磺酸內鹽，18mmol/L 二硫蘇糖醇,2% (v/v)膠條緩沖液(IPG buffer) ,0. 05%(w/v)的溴酹藍。2)等電聚焦水化結束后將膠條轉移至Ettan IPGhor膠條槽中，進行等電聚焦。等點聚焦程序設置為step,500VXlh !Gradient，1000VX Ih gradient, 8000VX 20000Vh ；Gradient,8000VX60000Vh ；3)膠條平衡將聚焦好后的IPG膠條進行平衡。采用兩步平衡法，每次平衡15min，平衡緩沖液配制如下膠條平衡液母液6mol/L尿素,2% (w/v)十二燒基磺酸鈉，50mol/LpH8. 8的Tris-HCL, 30%(v/v)的甘油，O. 002% (w/v)的溴酚藍，溶劑為去離子水。 膠條平衡緩沖液I :每IOmL膠條平衡液緩沖液母液加入IOOmgDTT。膠條平衡緩沖液II :每IOmL膠條平衡液緩沖液母液加入400mgIAA。4) SDS-PAGE電泳將平衡結束后的IPG膠條轉移至12. 5% (w/v)已聚合的聚丙烯酰胺分離膠上，以恒功率方式進行電泳先5W電泳20min，然后功率調制20W，繼續電泳5h.。當溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部時，關閉電源，結束電泳。5)凝膠染色、脫色將剝離的凝膠置于含40%(v/v)乙醇，10%(v/v)乙酸的固定液中固定 2-3h，之后轉入含有本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種制備蚯蚓總蛋白雙向電泳樣品的方法，其特征在于包括以下步驟：1）取吐泥1d后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨時間為5？15min；2）按蚯蚓干粉質量與以丙酮為溶劑的溶液A的體積之比為1：10的比例，向蚯蚓干粉中加入適量溶液A充分混合，？20℃靜置8？12h，得到蚯蚓總蛋白樣品；所述以丙酮為溶劑的溶液A中的溶質為：0.01？0.03mmol/L的二硫蘇糖醇、10%（w/v）的三氯乙酸；3）步驟2）中所得的蚯蚓總蛋白樣品離心20？30min：4℃，轉速12000？15000g，棄上清液；用？20℃下預冷的以丙酮為溶劑的溶液A洗滌沉淀，？20℃靜置1？2h，棄上清液；使用溶液A洗滌沉淀3次以上，直至上清液為無色透明為止,棄上清液，收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物；4）收集沉淀，得到蚯蚓總蛋白粗提物；5）將步驟4）中得到的蚯蚓總蛋白粗提物溶解于裂解緩沖液中振蕩混合1？2min后冰浴冷卻1min,如此重復振蕩混合1？2h；裂解緩沖液包括9.8mol/L尿素（urea），4%(w/v)的3？[3？(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPS），65mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，2%(v/v)的膠條緩沖液(IPG？buffer）,1%(w/v)的苯甲基磺酰氟（PMSF）；所述裂解緩沖液與蚯蚓總蛋白樣品的質量體積比為0.04g/400μL？0.05g/400μL；6）將步驟5）中混合液離心取上清液得到適合雙向電泳的蚯蚓總蛋白樣品。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王金花，葛偉麗，朱魯生，王軍，謝慧，王慧，
申請(專利權)人：山東農業大學，
類型：發明
國別省市：
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